Этот протокол имеет важное значение, поскольку он количественно измеряет фагоцитоз помечены Aspergillus фумигатуры Conidia человека лейкоцитов, наряду с присоединением Conidia к клеткам, и отсутствие взаимодействия поток цитометрии. Основным преимуществом этого метода является то, что он облегчает быстрый анализ большого количества ячеек. Кроме того, маркировка клеточных маркеров позволяет отделить оценку нейтрофилов и моноцитов в пределах одного образца.
В любом этом методе может быть использован для анализа других клинических соответствующих грибов, как Mucorales. Вместо этого красные кровяные тельца могут быть использованы в качестве фагоцитов. Для начала этой процедуры промокнете бумажное полотенце дезинфицирующим средством и поместите его в био-кабинет безопасности.
Поместите тарелку выращенного Aspergillus fumigatus поверх бумажного полотенца, чтобы предотвратить чрезмерное распределение летучих Conidia. Добавить 10 миллилитров PBS, содержащих 0,01%detergent на вершине гриба, и использовать шпатель Drigalski для распространения жидкости по пластине, и стереть темного цвета Conidia. Перенесите подвеску Conidia на 50 миллилитров через 30-метровый ситечко, которое снимет остаточную мицелию.
Добавьте еще 10 миллилитров PBS с моющим средством к пластине, распределите его шпателем и перенесите в ту же трубку через ситечко. Затем приготовьте стерильный раствор 0,1 молярного карбоната натрия, растворенного в PBS. И приготовьте 0,1 миллимолярдный раствор порошка FITC в этом карбонатом натрия.
Повторно приостанавливать 100 миллионов или менее Conidia, в пяти миллилитров этого раствора FITC, в 15 миллилитров трубки. Инкубировать в ротаторе при 37 градусах по Цельсию в течение 20 минут. Чтобы набухать до Конидии, повторно подать FITC помечены Conidia в пяти миллилитров RPMI среды, дополненный 10%FCS.
И инкубировать в ротаторе при 37 градусах по Цельсию в течение нужного времени. В шкаф биобезопасности поместите пять миллилитров буйного пальто в трубку 50 миллилитров. Заполните трубку буфером EL, и инвертировать три раза.
Инкубировать горизонтально в течение пяти-восьми минут, пока молочный вид смеси становится ясным. Затем центрифуга при температуре 300 Г, а при комнатной температуре в течение 10 минут. Отбросьте супернатант и повторно посовелите гранулы в один миллилитр буфера EL путем трубопроводов.
Добавьте еще 24 миллилитров буфера EL и несколько раз инвертировать трубку. Центрифуга при температуре 300 Г и при комнатной температуре в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и перерасходуйте клетки в одном миллилитров RPMI media, дополненном 10%FCS.
Для начала, передача двух миллионов лейкоцитов и четыре миллиона FITC помечены Conidia в 1,5 миллилитров RPMI дополнен 10%FCS, на 12-ну культуры пластины. Включите контроль над клетками только без Конидии и контроль над клетками с необляблой Конидией. Инкубировать пластину в инкубаторе увлажненной двуокиси углерода, при 37 градусах по Цельсию в течение желаемого количества времени.
Когда инкубация завершена, используйте сотовый скребок для сбора клеток, и передать их в трубку 15 миллилитров. Во-первых, положить 100 микролитров каждого образца и элементы управления в один колодец из 96-хорошо V-нижней пластины. Добавьте 150 микролитров PBS, содержащих два миллимолара EDTA для стирки.
Для компенсации цвета, поместите один миллион клеток без Conidia для каждого цвета, в других колодцах пластины. Включите колодец клеток, которые будут оставлены неудержимыми. Добавьте 150 микролитров PBS, содержащих два миллимолара ЭДТА, к каждому колодец для мытья.
Затем накройте тарелку клейкой фольгой и центрифугой при температуре 300 Г и при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем снимите фольгу и отбросьте супернатант, быстро и силой инвертировать пластину только один раз над раковиной, или одноразовым бумажным полотенцем. Повторное использование клеток в 100 микролитров смеси антител, и хорошо перемешать с помощью пипетки.
Для цветовых компенсаций, повторно использовать соответствующие клетки в 100 микролитров PBS, содержащих два миллимолара ЭДТА, и добавить один тип антител к каждому хорошо, в том же количестве, используемом в смеси антител. Накрыть клейкой фольгой и инкубировать при комнатной температуре в темное время суток в течение 20 минут. После этого снимите фольгу и добавьте 150 микролитров PBS, содержащих два миллимолара ЭДТА, к каждому хорошо для мытья.
Снова накройте тарелку клейкой фольгой. Центрифуга при температуре 300 Г и при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем удалите фольгу, и отбросить supernatant быстро и силой инвертирования пластины либо раковина или одноразовое бумажное полотенце.
Повторное распределение клеток в 200 микролитров PBS, содержащих 2 миллимолярные ЭДТА, и передача клеточной подвески из каждой хорошо, в отдельную круглую нижнюю трубку. Запустите поток цитометра, и дайте ему прогреться. В программном обеспечении для приобретения создайте новый эксперимент, а также навейте и отмейте новые образцы.
Настройка параметров и детекторов для соответствующих фторфоров, как указано в текстовом протоколе. В этом программном обеспечении отображаются соответствующие точечные графики, изложенные в текстовом протоколе. Используя только образец клеток, приобрести некоторые клетки и установить ворота вокруг лейкоцитов.
Основываясь на воротах лейкоцитов, ворота для CD45 положительных клеток, чтобы отделиться от Conidia в SSC CD45 участка. В точечном сюжете CD14, CD66b, ворота нейтрофилов и моноцитов отдельно. После этого, изменить из клеток только образец, на неочерпаемый Conidia.
В точечном сюжете, анти-FITC, APC FITC, отображение нейтрофилов в установленных квадрантах для анти-FITC, и FITC сигналов. Откройте представление статистики и отрегулируйте квадранты, позволяя максимум 1% ячеек в квадрантах No1, No2 и No4. Повторите этот процесс для ворот моноцитов. В воротах лейкоцитов записывают все образцы не менее чем с 20 000 событий.
Фагоцитоз КОНидии, помеченной FITC нейтрофилами человека, можно прочитать из статистических представлений. В этом исследовании используется цитометрический метод быстрого потока для измерения взаимодействия фумигатов Aspergillus Conidia с большим количеством первичных лейкоцитов человека. Использование соответствующих антител и gating стратегии показано здесь, общее gating человека лейкоцитов FSC и SSC характеристики, сопровождается разделением лейкоцитов в свободной Конидии, пан лейкоцитов маркер, CD45.
Конидия может достигать почти размера клеток во время цитометрии потока, особенно при использовании опухшие Conidia, и или долго инкубации раз, и, таким образом, может купить нам анализ. Поскольку первичные моноциты и нейтрофили человека по-разному берут Конидию, этот протокол позволяет проводить отдельный анализ популяции этих клеток на основе окрашивания с устоявшимися маркерами клеточной линии, CD14 для моноцитов и CD66b для нейтрофилов. Процент первичных фагоцитов человека, интернализации Conidia может быть весьма переменной среди доноров крови, но также зависит от экспериментальных факторов, таких как инкубационое время и отек состояние Конидии.
Интернализация спор может быть обнаружена после 0,5 часов совместной инкубации, и увеличивается со временем. Предварительно опухшие Conidia принимаются легче, чем споры отдыха, даже в короткие инкубационые времена. Если Конидия фиксируются формальдегидом, фагоцитоз уменьшается по сравнению с родной Конидией.
После этой процедуры, супернатанты со-инкубированных иммунных клеток и Conidia могут быть собраны и проанализированы Элизой, чтобы проверить, если взаимодействие вызывает высвобождение цитокинов иммунными клетками. Пожалуйста, помните, что человеческая кровь потенциально может передавать инфекционные заболевания. Эта работа требует вакцинации по всему гепатиту В, использования био-безопасности шкаф, а также носить перчатки на лабораторном пальто.
