Наш протокол демонстрирует, что ЭКМ может способствовать адипогенной дифференциации в отсутствие классических адипогенных посредников и первым демонстрирует специфическое заболевание регулирование клеточного метаболизма ЭКМ. Наша методика обеспечивает инструмент для вскрытия роли ЭКМ и адипоцитов в жировой метаболизм тканей и позволяет изучить роль ECM в регулировании жировой ткани гомеостаза. По сравнению со стандартной культурой 2D клеток, наша 3D-модель позволяет более надежное обследование и вскрытие перекрестного разговора между адипоцитами и жировой ткани ECM в контексте диабета типа 2.
Мы рекомендуем, начиная с небольших образцов, чтобы оценить, насколько хорошо он клетчатый. Имейте в виду, есть межпространственная изменчивость в том, насколько хорошо клетки растут и насколько хорошо ткани decellularizes. Важно наблюдать за тканью до и после каждого шага, чтобы обеспечить децеллюляризованную ткань и понять потенциальные различия между образцами.
После получения висцеральной жировой ткани или НДС от хирургии, подготовить его к хранению, добавив 5-10 граммов ткани до 15-25 миллилитров замораживания буферного раствора в 50 миллилитров конической трубки. Полностью погрузите образец и храните его при температуре минус 80 градусов по Цельсию до децеллюляризации. Для преадипоцитной изоляции поместите два грамма свежего образца нетронутого НДС в 20 миллилитров раствора коллагеназы II типа, затем вставьте стерильные ножницы в трубку и тщательно измельчите ткань.
После фарша до мелкой суспензии, инкубировать его в раствор коллагеназы при 37 градусов по Цельсию на орбитальной шейкер в течение 60 минут. После инкубации, фильтровать в результате переваривается через 100 микрометровую нейлоновую сетку в свежей 50 миллилитров конической трубки. Переваренной должна быть желто-оранжевая жидкость с умеренной вязкостью и небольшим количеством остаточных нитей непереваренной ткани.
Центрифуга образца в 270 раз г в течение 10 минут, удалить супернатант и повторно помыть гранулы клетки в двух миллилитров 1X РБК лизирования раствор с пипеткой. Инкубировать раствор в течение одной минуты при 25 градусах по Цельсию, затем добавить 10 миллилитров 15%FBS DMEM F12 и центрифугировать его в 270 раз г в течение 10 минут. Для подготовки ECM, заморозить / разморозить ранее замороженный образец НДС до 37 градусов по Цельсию, инкубируя его в предварительно нагретой водяной бане в течение 20 минут с периодическим нежным ручным возбуждением.
После размораживания перенесите ткань обратно до минус 80 градусов по Цельсию в течение 20 минут и повторите процесс замораживания/оттепели три раза, заканчивающийся оттаиванием. Используйте стерильные типсы для переноса образца НДС в свежую 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую 15-25 миллилитров энзиматического раствора 1, чтобы убедиться, что образец полностью погружен. Затем инкубировать его на ночь при 37 градусах по Цельсию при встряхивании при 130 об/мин.
На следующий день, мыть образец три раза с 15-25 миллилитров промывки буферного раствора, сливая раствор после каждой стирки. Перенесите образец в свежую 50-миллилитровую трубку с 15-25 миллилитров энзиматического раствора 2 и инкубировать его на ночь. Повторите промывки с промывки буферного раствора и передать образец в свежую трубку, содержащую 15-25 миллилитров растворителя полярного растворителя.
Инкубировать образец на ночь во время встряхивания. После инкубации с растворителем полярного растворителя, важно изучить образец для удаления липидов. Если большая часть липидов не удаляется, может потребоваться повторить этот шаг.
Может использоваться более короткое время инкубации. После инкубации перенесите образец в свежую трубку, содержащую 15-25 миллилитров промывки буферного раствора, и трижды вымойте образец на шейкере. Затем мыть образец три раза с 70%этанола раствор, сливая этанол после каждого мытья.
Вымойте образец один раз раствором для хранения, затем используйте стерильные типсы для переноса в свежую трубку, содержащую 15-25 миллилитров раствора для хранения, чтобы полностью погрузить его. Образец может храниться при четырех градусах цельсия в течение одного месяца. Изопропанол и этанол легковоспламеняющиеся и должны быть при комнатной температуре и утилизироваться в легковоспламеняющихся отходах.
Любые человеческие отходы должны быть утилизированы отдельно от обычных биологических отходов. Перенесите хранящиеся фрагменты ECM в отдельные скважины пластины из 24 скважин со стерильными типсами, добавляя столько фрагментов, сколько требуется для запланированных анализов ниже по течению. Вымойте их три раза с 500 микролитров 70% этанола на орбитальном шейкере, а затем увлажнить их путем мытья три раза с PBS.
Используйте стерильные ножницы, чтобы разрезать ECM на 100 миллиграмм фрагментов. Поместите каждый фрагмент в один колодец 24-хорошо пластины и инкубировать пластины при 25 градусов по Цельсию в течение 15 минут, чтобы избыток PBS выдавлить из фрагментов. Затем осторожно удалите остатки PBS из колодцев с пипеткой.
Семя каждого фрагмента с 20 микролитров преадипоцитов клеточной подвески путем пипетки клеток непосредственно в ECM. Поместите наконечник пипетки в ECM и аккуратно изгнать его в центр матрицы убедившись, что подвеска ячейки не переполнены и в конечном итоге в нижней части хорошо. Если подвеска ячейки выливается из ECM, удалите наконечник пипетки из этого места и вставьте его в другом месте в ECM.
После посева клеток, инкубировать ECM в течение 40 минут при 37 градусах по Цельсию. Заполните каждую колодец 500 микролитров средств роста, чтобы покрыть семенами фрагментов ECM. Культура клеток при 37 градусах Цельсия и 5%углекислого газа в течение 72 часов.
После 72 часов, тщательно аспирировать рост средств массовой информации, не нарушая фрагмент ECM. Добавить 500 микролитров дифференциации средств массовой информации и культуры клеток в течение 14 дней изменения средств массовой информации каждые два-три дня. Проверьте дифференциацию с помощью световой микроскопии.
Клетки будут накапливать липиды, становятся коричнево-желтого цвета и становятся более сферическими, как они дифференцируются. Подготовка жировой ткани ECM, посев с предадипоцитами, и в пробирке дифференциации в зрелые адипоциты была проверена сканирование электронной микроскопии, которая показала децеллюляризации ECM и последующей рецитуляции липидов, содержащих адипоциты при повторном посеве и дифференциации. Коллаген 1 специфической иммуногистохимии децеллюляризованных ECM показал поддержание коллагена микро архитектуры в то время как масло Red-O окрашивания живых и фиксированных 3D ECM-адипоцитов конструкций показали липиды, содержащие адипоциты.
Адипоциты, дифференцированные в ECM, были проверены на адипогенные гены с использованием количественных ПЦР в режиме реального времени, которые показали, что эти гены регулируются в дифференцированных клетках по сравнению с недифференцированными преддипоцитами, культурированными в ECM. Отображается полная разница в уровнях стенограммы. Четыре комбинации ЭКМ и адипоцитов у больных сахарным диабетом и нондиабетических субъектов подверглись метаболическому фенотипированию.
Нарушение поглощения глюкозы в липолитической функции было обнаружено в конструкциях из диабетических тканей. Важно отметить, что нендиабетические ЭКМ спасает инсулин стимулировали поглощение глюкозы и либолитической способности в диабетических адипоцитов. Загрязнение изолированных предадипоцитов, децеллюляризованной ткани и повторного сеяного ЭКМ не редкость.
Стерильность должна тщательно поддерживаться на протяжении всего протокола.
