Сердечно-сосудистые заболевания остаются причиной смерти номер один во всем мире. Традиционные модели in vitro опираются на монослойную культуру. Однако сердце, в частности сердечная мышца или миокард, является сложным по своей 3D-анизотропии и клеточному составу.
Поэтому крайне важно улучшить сложность состава тканей в моделях in vitro, чтобы лучше имитировать как клеточные компоненты, так и структуру миокарда. Здесь, в этой работе, мы демонстрируем протокол для разработки 3D-зрелой сердечной ткани человека, полученной из стволовых клеток, в новом микрофлюидном устройстве. Это устройство включает в себя 3D-основной тканевой канал с врожденными эллиптическими микропостами, которые вызывают высокие степени выравнивания окружающих гидрогелевых инкапсулированных сердечных клеток.
Основной канал окружен медиа-каналами с инъекционными портами, которые обеспечивают диффузию питательных веществ по всей ткани. Из-за осторожности, необходимой при обращении с микрофлюидными устройствами, визуальное представление этого протокола полезно для правильного установления 3D-сердечной ткани в микрофлюидном устройстве со встроенными микропостами для улучшения выравнивания тканей. Чтобы диссоциировать сердечный фибробласт человека, сначала выньте колбу из инкубатора.
Поместите внутрь шкафа биобезопасности и начните аспирировать отработанные среды из колбы. Затем возьмите три МЛ PBS 1X, чтобы промыть колбу. Закройте колпачок и закрутите колбу так, чтобы дно было правильно покрыто PBS.
Аспирировать PBS. Возьмите три МЛ 37 градусов трипсина и добавьте в колбу. Затем наклоните колбу и закрутите так, чтобы дно было полностью покрыто.
Затем помещают в инкубатор на четыре-шесть минут. Нейтрализуйте трипсин с помощью FGM3, взяв три МЛ и добавив их в колбу. Пипетка раствором вверх и вниз, чтобы выбить любые клетки, которые остаются на задней части колбы.
Соберите клеточную суспензию в 15 мл трубки Falcon. Возьмите 10 микролитров клеточной суспензии и дозируют в гемоцитометре для подсчета клеток с помощью микроскопа. Центрифугировать клеточную суспензию при 250 Г в течение четырех минут.
После центрифугирования аспирировать супернатант, стараясь не потревожить клеточную гранулу. Повторно суспендировать клеточную гранулу свежим FGM3, чтобы получить желаемые 75 миллионов клеток на суспензию ML. Повторно суспендируете ячейки, затем установите трубку со свободно установленным колпачком.
Чтобы диссоциировать кардиомиоциты, выньте пластину из инкубатора и аспирируют медиа. Возьмите шесть МЛ PBS и промыть скважины так, чтобы в каждой скважине было по одному ML PBS. Аспирировать PBS, стараясь не потревожить клетки, прикрепленные к пластине.
Добавьте шесть МЛ подогретого trypLE Express, чтобы в каждой скважине из шести скважин было по одному ML. Инкубировать клетки с трипле в течение 10 минут. Через 10 минут нейтрализуйте trypLE шестью МЛ RPMI плюс B27 плюс инсулин, чтобы вы добавили один мл RMPI в каждую скважину.
Используйте одну пипетку ML, чтобы собрать раствор и взорвать его о задней части скважин, чтобы обеспечить снятие всех ячеек. Соберите клеточную суспензию в 15 мл трубки Falcon. Центрифугировать трубку при 300 Г в течение трех минут.
После центрифугирования аспирируют жим и триплЕ. Этот шаг важен для промывания чувствительных кардиомиоцитов. Этот шаг гарантирует, что все trypLE исчезнет в 3D-образовании сердечной ткани.
Повторное суспендирование клеточной гранулы в пяти МЛ RPMI плюс B27 плюс инсулин. Используйте одну пипетку ML, чтобы пипетку раствора вверх и вниз, чтобы обеспечить однородную клеточную суспензию. Возьмите 10 микролитров клеточной суспензии для подсчета гемоцитометром.
Центрифугировать ячейки при 300 Г в течение трех минут. Аспирировать жижи после центрифугирования во второй раз. Добавьте соответствующее количество RPMI плюс B27 плюс инсулин, чтобы достичь 75 миллионов клеток на суспензию ML, а затем повторно суспендировать.
Чтобы приготовить коллагеновый раствор для инкапсуляции, все реагенты должны быть на ледяной коробке в капюшоне. Затем возьмите 75 микролитров запасного коллагена. Коллаген очень вязкий, поэтому медленно усваивается пипеткой, затем дозируется в микроцентрифужной трубке на льду.
Возьмите 13,85 микролитра RPMI и добавьте к коллагену в трубку Falcon. Затем берут 10 микролитров фенола красного цвета и добавляют в смесь на льду и повторно суспендировали. Наконец, возьмите 1,15 микролитра одного нормального NaOH и добавьте в суспензию для нейтрализации.
Затем возьмите наконечник пипетки на 200 микролитров и повторно суспензию. Следующим шагом является инкапсуляция клеток внутри коллагенового метрогеля. Затем возьмите аликвоту из восьми микролитров КМ и добавьте в свежую трубку Falcon на льду.
Затем возьмите два микролитра CS и добавьте к этой клеточной смеси. Повторно суспендирует клеточную суспензию и захватите 5,6 микролитра клеточной суспензии и поместите в свежую трубку Falcon. Затем возьмите коллаген, который вы только что приготовили, возьмите четыре микролитра коллагена, затем возьмите 2,4 микролитра метрогеля.
Пипетка смеси вверх и вниз для обеспечения однородного распределения клеточной гидрогелевой суспензии. После того, как инъекция геля приготовлена, вы можете вставлять в устройства. Возьмите новый наконечник и повторно суспендируете.
Возьмите чашку Петри из устройств, вставьте наконечник в инъекционный порт и медленно и неуклонно вводите. Вы увидите, как канал устройства заполняется клеточной гидрогелевой суспензией. Как только другой порт будет заполнен, остановите инъекцию и снимите наконечник.
После инъекции переверните приборы пинцетем и поместите внутрь большую чашку Петри с водой в инкубаторе на девять минут. Через девять минут выньте устройства из инкубатора и переверните вертикально, затем поместите обратно в инкубатор еще на девять минут, чтобы завершить полимеризацию гидрогеля. Теперь пришло время добавить медиа.
Итак, возьмите RMPI плюс B27 и вставьте наконечник в медиапорт и начните медленно нажимать. Затем сделайте это на противоположном медиапорте. Вы можете обнаружить, что носитель не вводится, поэтому вы можете поместить каплю носителя поверх порта, а затем взять пипетку и использовать отрицательное давление, чтобы протащить носитель с другой стороны.
Таким образом, вы увидите, как медиа начинают тянуться через канал. Как только медиа будет добавлено во все медиаканалы, устройства будут помещены обратно в инкубатор при 37 градусах. Микрофлюидное устройство показано в левом верхнем углу.
На этом изображении показаны первый, седьмой и 14-й дни культуры. После 14 дней культивирования клетки должны конденсироваться в высоко выровненные структуры, которые образуются вокруг микропостов. Следы 14-го дня показаны здесь в С спонтанного сокращения, а также иммунофлуоресцентные изображения окрашенных актинами и окрашенных сердечными маркерами тканей.
Что следует видеть, так это высокоровненные актиновые волокна, которые образуются через 14 дней в культуре, а также параллельные полосатые зрелые саркомери и локализованные щелевидные соединения. Во время этой процедуры очень важно держать все материалы при низких температурах на льду во время инъекции гидрогеля в клетку, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию. С микрофлюидными устройствами следует обращаться осторожно, как во время изготовления, инъекции, так и при расширенной культуре тканей.
Инъекции клеток должны быть устойчивым процессом, чтобы гарантировать, что весь канал заполнен во время быстрого выполнения, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию или высыхание гидрогеля перед добавлением среды.
