Большинство исследований с липосомы полагаться на смелые методы внутренне предполагая, что все липосомы, чтобы быть идентичными. Изучая одиночные липосомы, можно наблюдать значительные неоднородности. Один липосомный метод, представленный здесь, позволяет нам изучать сотни липосом одновременно и обнаруживать неоднородность по их размеру и составу.
Метод можно легко настроить для изучения других систем на одном липосомном уровне, таких как взаимодействие белковой мембраны. Все, что вам нужно, это соединение вы изучаете, чтобы быть флуоресцентно помечены. С помощью этого видео, мы предоставляем исследователям с инструментом о том, как они могут выполнять одиночные исследования липосомы.
Мы надеемся, что ясно, что анализ может быть легко изменен для изучения целого ряда других научных тем. Для начала смешайте подготовленные липидные запасы 138 микролитров POPC и 120 микролитров холестерина в свежем стеклянном флаконе. Затем добавьте 500 микролитров каждый из двух флуоресцентно помеченных липидов и 50 микролитров DSPE-PEG-биотина.
Ослабить крышку стеклянного флакона и оснастки заморозить флакон в жидком азоте в течение одной-двух минут. Лиофилизовать замороженную липидную смесь на ночь в заморозить сушилку. Утром добавьте один миллилитр 200 миллимолярный буфер D-сорбитола в сухие липиды.
Нагрейте смесь до 45 градусов по Цельсию и подвергните ее магнитному перемешиванию в течение по крайней мере одного часа. Затем заморозить липидную суспензию, окунув флакон в жидкий азот и ждать, пока подвеска полностью заморожена. Затем окуните замороженную подвеску в нагревательной ванне при 55 градусах Цельсия до тех пор, пока смесь не будет полностью разморожена.
Выставить смесь в общей сложности 11 циклов замораживания-оттепели. После этого, используя комплект мини экструзии, экструдировать липосомную подвеску один раз через 800 нанометровый поликарбонатный фильтр. Смешайте 1 200 микролитров BSA и 120 микролитров биотина BSA.
Добавьте 300 микролитров смеси к каждому хорошо в восемь хорошо слайд и инкубировать слайд в течение 20 минут при комнатной температуре. Слегка наклоните слайд и от края каждого хорошо аспирировать среды. Немедленно добавьте 300 микролитров буфера HEPES в каждый колодец для мытья.
Вымойте каждый хорошо восемь раз в общей сложности. Добавьте 250 микролитров стрептавидина и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. Повторите восемь моет, как описано ранее.
Поместите слайд на микроскоп и отрегулируйте микроскоп джойстик, чтобы сосредоточиться на поверхности камеры. Это можно легко сделать с помощью увеличенного сигнала лазерного отражения от интерфейса стеклянного буфера в качестве руководства. В микроцентрифуговую трубку добавьте 10 микролитров разбавленного липосомного бульона, содержащего 20 микромолеевых липидов.
Перенесите 100 микролитров буфера из камеры в трубку микроцентрифуга, смешайте правильно и перенесите 110 микролитров обратно в камеру. Поместите камеру под микроскоп и используйте рудиментальный микроскоп, способный обнаруживать сигнал от липосомных флюорофоров, чтобы наблюдать, как липосомы обездвижены на поверхности. Настройка микроскопа, как описано в рукописи.
Для изображения как DOPE ATTO488 и DOPE ATTO655 флюорофоры в липосомах, изображение нескольких каналов. Убедитесь, что каждый канал изображен последовательно, чтобы избежать перекрестного возбуждения. Например, сначала сделайте одно изображение, захватывающее на 488 нанометров и эмиссию показаний на 495-590 нанометров.
После этого измените настройки и сделайте еще одно изображение на 633 нанометров, но считыв выбросы только на 660-710 нанометров. Анализировать. В меню изображения выберите цвет и используйте функцию канала слияния для создания композита из двух каналов. Обратите время на то, чтобы липосомы, изображенные в двух разных каналах, отображали хорошую коа локализацию или произошел видимый дрейф.
Для обнаружения частиц откройте меню плагинов, выберите ComDet и нажмите кнопку обнаружения частиц. В ComDet убедитесь, что настройки верны, и нажмите OK. После запуска анализа два всплывающих окна с результатами и резюме показывают. Таблица результатов содержит соотношение интенсивности между двумя каналами.
Экспорт результатов таблицы данных, содержащих данные о совместной локализации. Пригоните гистограмму соотношения интенсивности с гауссийской функцией и извлекайте среднее и стандартное отклонение. Среднее и стандартное отклонение может быть использовано для расчета степени неоднородности.
Подготовьте липосомную формулу, которая была выдавнана несколько раз через 50 нанометровый фильтр. Калибруйте размер липосом, сравнивая интенсивность флуоресценции с данными о размерах DLS. С теми же экспериментальными настройками микроскопа, что и ранее, изображение липосом калибровки.
Участок квадратный корень интенсивности гистограммы флуоресценции интенсивности липосомы калибровки. Fit гистограммы с журналом нормального распределения и извлечь среднюю интенсивность флуоресценции липосомы калибровки, как геометрическое среднее. Чтобы определить связь между интенсивностью квадратного корня и липосомой размера, вычислить фактор коррекции, разделив средний диаметр липосомы, полученный от динамических измерений рассеяния света с геометрическим средним интенсивности квадратного корня.
Рассчитайте квадратные значения интенсивности корней для липосом в эксперименте композиционной неоднородности и преобразуйте эти два диаметра путем умножения с фактором коррекции. Участок значение соотношения интенсивности, как функция диаметра для композиционных липосом неоднородности, таким образом, достижение неоднородности в качестве функции липосомного размера для популяции липосом, охватывающих от примерно 50 нанометров до 800 нанометров. В этом протоколе, успешная иммобилизация поверхности липосомы была немедленно очевидна после добавления липосомного раствора в камеру, указанную дифракцией ограниченных пятен интенсивности.
Рекомендуется обездвижить достаточно липосомы для достижения плотности от 300 до 400 липосом на кадр. Более низкая плотность делает анализ данных более трудоемким, в то время как более высокая плотность затрудняет различие одиночных липосом. Если все поле зрения находится не в должном фокусе, образец пластины может быть наклона.
Кроме того, если липосомы кажутся большими и размытыми, это указывает на то, что буфер в камере мог испариться и поверхность высохла. Гистограммы соотношения интенсивности обычно показывают гауссийское распределение вокруг среднего значения соотношения. Если наблюдаются сильные отклонения от гауссийского распределения, это указывает на проблему чувствительности обнаружения, предполагая, что подмножество липосом, показывающих более слабый сигнал, было исключено.
После установки гистограммы соотношения интенсивности с гауссийской функцией, степень значения неоднородности 0,23 была переведена на 32% населения, отличающегося более чем на 23% от среднего соотношения молара ансамбля. Было установлено, что количественная оценка экспериментальной неопределенности составляет 0,1. Анализ никогда не будет лучше, чем материалы, которые вы используете так высокое качество неиламинарных липосом имеют важное значение.
Поэтому, когда вы готовите их, не срезать любые углы, такие как оставляя замораживания оттепели циклов. Плохие изображения приведут к высокой экспериментальной неопределенности и заставить вас переоценить неоднородность, так что найтмите время, чтобы приобрести хорошие в фокусе изображения. Что анализ в основном сделать, это изучить плотность поверхности флуоресцентной этикетки.
Если этот флуоресцентный ярлык находится на перк изолированных липидов, то этот анализ может быть использован для качества тест липосомы для доставки наркотиков. Установка была применена для изучения того, как пептиды связываются с мембранами и чувствуют кривизну. Это дало исследователям уникальные идеи молекулярных сигналов, которые регулируют, как пептиды сортируются внутри клеток.
