La mayoría de las investigaciones con liposomas se basan en técnicas audaces que intrínsecamente asumen que todos los liposomas son idénticos. Mediante el estudio de liposomas individuales, se pueden observar inhomogeneidades significativas. La única técnica de liposomas presentada aquí nos permite estudiar cientos de liposomas simultáneamente y detectar inhomogeneidades en su tamaño y composición.
El método se puede ajustar fácilmente para estudiar otros sistemas en un solo nivel de liposomas como interacciones de membrana proteica. Todo lo que necesitas es que el compuesto que estudias sea etiquetado fluorescentemente. Con este video, proporcionamos a los investigadores la herramienta sobre cómo pueden realizar estudios de liposomas individuales.
Esperamos que esté claro que el ensayo se puede modificar fácilmente para estudiar una serie de otros temas científicos. Para empezar, mezclar las reservas de lípidos preparadas 138 microlitros de POPC y 120 microlitros de colesterol en un vial de vidrio fresco. A continuación, añada 500 microlitros cada uno de los dos lípidos con etiqueta fluorescente y 50 microlitros de DSPE-PEG-biotina.
Afloje la tapa del vial de vidrio y congele el vial en nitrógeno líquido durante uno o dos minutos. Liofilizar la mezcla de lípidos congelados durante la noche en un secador de congelación. Por la mañana, añadir un mililitro de 200 militros D-sorbitol tampón a los lípidos secos.
Calienta la mezcla a 45 grados Centígrados y exponga a la agitación magnética durante al menos una hora. A continuación, congele la suspensión de lípidos sumergiendo el vial en nitrógeno líquido y espere hasta que la suspensión esté completamente congelada. A continuación, sumerja la suspensión congelada en un baño de calefacción a 55 grados centígrados hasta que la mezcla esté completamente descongelada.
Exponer la mezcla a un total de 11 ciclos de congelación y descongelación. Después de eso, usando un mini kit de extrusión, extruya la suspensión liposoma una vez a través de un filtro de policarbonato de 800 nanómetros. Mezclar 1.200 microlitros de BSA y 120 microlitros de biotina BSA.
Añadir 300 microlitros de la mezcla a cada pozo en un portaobjetos de ocho pozos e incubar el portaobjetos durante 20 minutos a temperatura ambiente. Incline ligeramente la corredera y desde el borde de cada pozo aspirar el medio. Agregue inmediatamente 300 microlitros de tampón HEPES en cada pozo para lavar.
Lavar cada pozo ocho veces en total. Añadir 250 microlitros de estreptavidina e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Repita los ocho lavados como se describió anteriormente.
Coloque la diapositiva en el microscopio y ajuste el joystick del microscopio para centrarse en la superficie de la cámara. Esto se puede hacer fácilmente usando la señal de reflexión láser aumentada de la interfaz del búfer de vidrio como guía. En un tubo de microcentrífuga, añadir 10 microlitros del caldo de liposoma diluido que contenga 20 lípidos totales micromolares.
Transfiera 100 microlitros de tampón desde la cámara al tubo de microcentrífuga, mezcle correctamente y transfiera los 110 microlitros de nuevo a la cámara. Poner la cámara bajo el microscopio y utilizar un ajuste de microscopio rudimental capaz de detectar la señal de los fluoróforos liposomas para observar los liposomas que se inmovilizan en la superficie. Configure el microscopio como se describe en el manuscrito.
Para imaginar los fluoróforos DOPE ATTO488 y DOPE ATTO655 en los liposomas, imagine varios canales. Asegúrese de que cada canal se toma una imagen secuencial para evitar la excitación cruzada. Por ejemplo, primero tome una imagen apasionante a 488 nanómetros y la emisión de lectura a 495 a 590 nanómetros.
A partir de entonces, cambie la configuración y tome otra imagen a partir de 633 nanómetros, pero la emisión de lectura sólo a 660 a 710 nanómetros. Analizar. En el menú de imágenes, elija color y utilice la función de canal de fusión para crear un compuesto de los dos canales. Observe si los liposomas en dos canales diferentes muestran una buena co-localización o si se produjo una deriva visible.
Para detectar partículas, abra el menú de plugins, elija ComDet y haga clic en detectar partículas. En ComDet, compruebe que la configuración es correcta y pulse OK. Después de ejecutar el análisis, se muestran dos ventanas emergentes con resultados y resumen. La tabla de resultados contiene la relación de intensidad entre los dos canales.
Exporte los resultados de la tabla de datos que contienen los datos de co-localización. Ajuste el histograma de la relación de intensidad con una función gaussiana y extraiga la media y la desviación estándar. La media y la desviación estándar se pueden utilizar para calcular el grado de inhomogeneidad.
Preparar una formulación liposoma que ha sido extruida varias veces a través de un filtro de 50 nanómetros. Calibre el tamaño de los liposomas comparando la intensidad de la fluorescencia con los datos de tamaño de DLS. Con los mismos ajustes experimentales del microscopio que anteriormente, imagine los liposomas de calibración.
Trazar un histograma de intensidad de raíz cuadrada de la intensidad de fluorescencia de los liposomas de calibración. Ajuste el histograma con una distribución normal del registro y extraiga la intensidad media de fluorescencia de los liposomas de calibración como la media geométrica. Para determinar la relación entre la intensidad de la raíz cuadrada y el tamaño del liposoma, calcule el factor de corrección dividiendo el diámetro liposoma promedio obtenido de las mediciones dinámicas de dispersión de luz con la media geométrica de la intensidad de la raíz cuadrada.
Calcular valores de intensidad de raíz cuadrada para los liposomas en el experimento de inhomogeneidad compositiva y convertir estos dos diámetros multiplicando con el factor de corrección. Trazar el valor de la relación de intensidad en función del diámetro de los liposomas de inhomogeneidad compositiva, logrando así la inhomogeneidad en función del tamaño del liposoma para una población de liposomas que abarcan desde aproximadamente 50 nanómetros hasta 800 nanómetros. En este protocolo, la inmovilización superficial exitosa de liposomas fue inmediatamente evidente tras la adición de la solución de liposoma a la cámara indicada por las manchas de intensidad limitada de difracción.
Se recomienda inmovilizar suficientes liposomas para lograr una densidad de 300 a 400 liposomas por fotograma. Una densidad más baja hace que el análisis de datos consuma más tiempo, mientras que una mayor densidad hace que sea difícil distinguir liposomas individuales. Si todo el campo de visión no está en el foco adecuado, la placa de muestra podría estar inclinada.
Además, si los liposomas parecen grandes y borrosos, esto indica que el tampón en la cámara podría haberse evaporado y la superficie seca. Los histogramas de la relación de intensidad suelen revelar una distribución gaussiana alrededor de un valor de relación media. Si se observan fuertes desviaciones de una distribución gaussiana, indica un problema de sensibilidad de detección que sugiere que se ha excluido un subconjunto de liposomas que muestran una señal más débil.
Después de ajustar el histograma de la relación de intensidad con una función gaussiana, se tradujo un grado de valor de inhomogeneidad de 0,23 al 32% de la población que diferenció en más del 23% de la relación molar media del conjunto. Se encontró que la cuantificación de la incertidumbre experimental era 0,1. El ensayo nunca será mejor que los materiales que usas, por lo que los liposomas unilaminar de alta calidad son esenciales.
Por lo tanto, cuando los prepare, no corte ninguna esquina, como dejar fuera los ciclos de congelación y descongelación. Las imágenes deficientes conducirán a una gran incertidumbre experimental y te harán sobreestimar la inhomogeneidad, así que tómate el tiempo para adquirir buenas imágenes enfocadas. Lo que el ensayo básicamente hace es estudiar la densidad superficial de la etiqueta fluorescente.
Si esta etiqueta fluorescente está en un lípido percolado, entonces este ensayo se puede utilizar para probar liposomas de prueba de calidad para la administración de medicamentos. La configuración se ha aplicado para estudiar cómo los péptidos se unen a las membranas y detectar la curvatura. Esto ha dado a los investigadores una visión única de las señales moleculares que gobiernan cómo se clasifican los péptidos dentro de las células.
