Этот метод отслеживает структуры дрожжевых клеток в трех измерениях в течение многих минут, что позволяет нам изучать динамику внутриклеточных органелл и отсеков. 4D-изображение гарантирует, что мы можем сделать надежные выводы о внутриклеточной динамике, особенно для структур или маркеров, которые могут быть переходными. Демонстрация процедуры будет Натали Джонсон, postdoc из моей лаборатории.
Начните с выращивания ночной культуры дрожжей штамм интереса в пяти миллилитров нефлуоресцентных синтетических определены, или NSD, средний, в 15 миллилитров сбит с толку колбу с хорошей аэрации, при 23 градусов по Цельсию. За три-четыре часа до анализа разбавляют логаритмическую фазовую дрожжевую культуру в свежей среде NSD, так что окончательная оптическая плотность на 600 нанометров, или OD600, будет от 0,5 до 0,8 на момент визуализации. По крайней мере, за час до того, как культура будет готова, центрифуга алицита в два миллиграмма на миллилитр Конканавалина раствор в течение пяти минут на полной скорости, чтобы гранулировать любые частицы, и добавить 250 микролитров супернатанта в чистый 35-миллиметровый стеклянный нижний микроскопии блюдо.
Через 15 минут, мыть блюдо два-три раза с двумя миллилитров дистиллированной воды на стирку, добавив 250 микролитров дрожжевой культуры в Concanavalin покрытием блюдо после того, как она высохнет. Подождите 10 минут, чтобы клетки придерживаться, прежде чем аккуратно мыть блюдо еще два-три раза с двумя миллилитров свежей среды NSD. Затем накройте клетки двумя миллилитров свежего NSD.
Чтобы изображение дрожжевых клеток, выберите 63X масляное погружение объектив с численным отверстием не менее 1,4 на конфокальный световой микроскоп. Здесь объектив 100X также может быть использован вместо объектива 63X. Затем поместите блюдо на объектив цели, пятнистый с погружением нефти.
Из меню высадки вкладки Режим приобретения выберите xyzt. Под вкладкой XY форматировать размер кадра до 256 ширины на 128 высот. Используйте максимальную скорость сканирования, которая, как правило, составляет порядка восьми килогерц.
Включите двунаправленное X-сканирование, если оно доступно, и отрегулируйте коэффициент масштабирования до девяти, что приведет к размеру пикселя приблизительно 80 нанометров. Если используется цель 100X, соответствующим образом отрегулируйте коэффициент масштабирования, чтобы сохранить размер пикселя приблизительно 80 нанометров. Затем установите накопление линии до четырех или шести.
Установите пинхол до 1,2 airy единиц, и включите белый свет лазера, если таковые имеются. Затем установите длину волны возбуждения и процентную мощность лазера для каждого канала флуоресценции. При наличии включить режим подсчета фотона под вкладкой конфигурации, отбирая максимальное время интеграции.
Для каждого канала флуоресценции назначьте детектор высокой чувствительности, установите диапазон длин волн выбросов и включите режим подсчета фотона, если таковые имеются. Установите время gating окно 0,6 до 10 наносекунд для каждого канала флуоресценции, чтобы избежать захвата отраженного света от стеклянной тарелки. Затем включите яркие полевые изображения и выберите детектор низкой чувствительности для сбора данных.
Включите режим живой визуализации и включите усиление в ярком полевом канале до тех пор, пока клетки не будут хорошо видны. Если в режиме подсчета фотона измените диапазон серых значений с ручных на автоматический для просмотра флуоресцентного сигнала. Установите стек для изображения всего объема дрожжевых клеток и укажите направленность изображения таким образом, чтобы вниз движется к крышке скольжения.
Установите интервал в 0,25-0,35 микрометра, чтобы получить от 20 до 25 оптических секций на стек, и включите поток Galvo, если он доступен. Для типичного фильма установите интервал времени между стеками до двух секунд и установите продолжительность фильма до 5-10 минут. Затем сохраните фильм в качестве файла LIF.
Для деконволюции фильма запустите соответствующую программу по деконволюции, которая использует классический алгоритм оценки максимальной вероятности, и откройте серию данных. Выберите мастера деконволюции и редактор параметров, чтобы подтвердить, что параметры изображения обнаружены и правильно отображаются. Измените значение среднего рефракционного индекса встраивания до 1,4, чтобы приблизиться к цитоплазме дрожжей.
Затем используйте редактор для оценки положения скольжения обложки. Выберите установите все проверенные и нажмите Принять, и выберите Введите мастера. Нажмите на следующую стрелку, чтобы обойти выбор функции распространения тока и обрезку этапов предварительной обработки, и пройдите через мастер деконволюции для каждого канала флуоресценции.
Выберите вычислительную функцию вертикального картирования и проинспектировать профиль интенсивности флуоресценции необработанных данных. Установите руководство в качестве режима для фоновой оценки введите фоновое значение и нажмите Кнопку Принять. Оставьте максимальное значение итераций на уровне 40 и введите расчетный сигнал к соотношению шума.
Затем выключите коррекцию отбеливателя и нажмите Deconvolve. Выберите Принять к следующему каналу в окне результата деконволюции, если шум достаточно удален без устранения подлинной флуоресценции из тусклых структур. После того, как все флуоресцентные каналы были удовлетворительно deconvolved, нажмите Все сделано и организовать красный канал первый, а затем зеленый, синий и яркий каналы поля, для последующего редактирования в ImageJ.
Затем сохраните последовательность изображений в качестве восьми битного файла TIF и выберите один файл на канал и контрастное растяжение в качестве режима преобразования. Для коррекции отбеливателя импортните деконвольные последовательности изображений в ImageJ и нажмите Image, Hyperstacks и Stack to Hyperstack, чтобы преобразовать изображения в гиперстаху. Выберите xyzct из меню высадки и введите количество каналов, срезов и таймфреймов.
Чтобы исправить флуоресценции каналов для отбеливания фотографий, выберите изображение, цвет, сплит каналов, а также для флуоресцентных каналов, выберите плагины, EMBLtools, bleach коррекции, и экспоненциальный Fit. Затем выберите каналы Изображения, Цвета и Слияния, чтобы объединить яркое поле и отбеливатель, исправленные каналы флуоресценции в гиперстаху, и сохранить деконволюции и отбеливатель исправлены гиперстах для последующего генерации фильма и редактирования в качестве восьми битного файла TIF. Чтобы преобразовать деконвольированный и искорректированный набор данных в масштабированный монтаж, выберите Plugins, IJ_Plugins и Make Montage Series, а также выберите соответствующий восьмитысячий гиперстах.
Нажмите Open и OK, чтобы признать, что все срезы будут использованы для создания монтажа, и нажмите OK еще раз, чтобы принять предложенное значение фактора масштаба. Сохранить оригинальный монтаж в качестве восьми битного файла TIF и выбрать Плагины, IJ_Plugins, Монтаж серии Hyperstack и OK, чтобы создать 4D гиперстаф из оригинального монтажа, который включает в себя все таймфреймы. Для создания исходного среднего проецируемого фильма сначала выберите Plugins, IJ_Plugins, Project Hyperstack и OK, чтобы принять параметры по умолчанию .Projection.
Сохраните средний прогнозируемый фильм в качестве восьми битного файла TIF и проинспектируете фильм, чтобы определить отдельные структуры, которые могут быть отслеированы в течение периода их маркировки. Определение структуры, которая может быть надежно отслеирована в течение всего фильма, и изоляция этой структуры для анализа, являются наиболее важными шагами процедуры. Затем следуйте инструкциям в руководстве пользователя плагина, чтобы изолировать структуры, представляющие интерес, редактируя монтаж.
Создайте 4D гиперстак из отредактированного монтажа на период, включая структуры, представляющие интерес, и сохраните отредактированный гиперстах. Для количественной оценки интенсивности флуоресценции с течением времени для изолированной структуры в отредактированной 4D-гиперстаке, выберите Plugins, IJ_Plugins и Analyze Edited Movie, вяйте интервал времени между стеками и нажмите OK. Чтобы создать заключительный фильм изолированной структуры, выберите Plugins, IJ_Plugins и Hyperstack проекта, укажите нарезы стека, которые должны быть включены, выберите среднюю интенсивность в качестве типа проекции и нажмите OK. Для создания 4D-гиперстака с исходными данными по отредактированным данным выберите плагины, IJ_Plugins, Слияние двух гиперстафок и место первым выше секунды. Для создания фильма из 4D-гиперстака с исходными данными по отредактированным данным выберите Plugins, IJ_Plugins и Project Hyperstack, укажите на фрагменты стека, которые должны быть включены, выберите среднюю интенсивность в качестве типа проекции и нажмите OK. Здесь первый кадр проекции необработанных данных по стеку можно сравнить с теми же деконвольтными и исправленными данными отбеливателя.
Эти кадры из того же deconvolved и отбеливатель исправлены фильм показать два цистерны, которые были проанализированы, которые сначала этикетки с зеленым Ванатадат сопротивления гликозиляции белка 4 или Vrg4 маркер, а затем с красным Secretory 7 или Sec7 гена транспорта белка маркера. Этот монтаж, созданный из deconvolved и отбеливатель исправлены гиперстах, показывает все оптические разделы в одно время точки до и после редактирования, чтобы изоляция сигнала от одного из выбранных цистерн. На этом рисунке показаны несколько кадров из финального фильма проецируемых стеков с исходными проекциями в верхней части фигуры и отредактированными проекциями внизу.
Количественная оценка зеленых и красных флуоресцентных сигналов от выбранного Golgi cisternae показывает, что зеленый маркер Vrg4 прибывает и сохраняется около 80 секунд, после чего красный маркер Sec7 прибывает и сохраняется около 60 секунд, с кратким перекрытием между двумя маркерами. При выполнении этой процедуры важно определить структуры, которые можно однозначно отслеживать на протяжении всей их жизни. Такой же анализ может быть выполнен после мутации или какого-либо другого типа специфических возмущений.
Этот метод открыл путь к изучению динамического поведения Golgi cisternae и эндоплазмических участков выхода стикулума с использованием дрожжей в качестве модельной системы.
