Этот метод может быть использован для оценки, как новые терапевтические агенты или стратегии, влияние или увеличить цитотоксические Т-клеток ответ во время рака поджелудочной железы. Этот метод позволяет быстро переваривать опухоли и стимулировать их в пробирке, позволяя одновременно проводить анализ нескольких параметров реакции Т-клеток, которые могут быть легко адаптированы для других применений. Для начала используйте типсы, перенесите опухоль на чашку Петри.
Храните пять миллилитров среды пищеварения в 50 миллилитровой трубке на льду, чтобы предотвратить начало ферментной активности. Возьмите небольшую алицита этого раствора, чтобы покрыть опухоль на чашке Петри. Используйте стерильный скальпель и типсы, чтобы разрезать опухоль на мелкие кусочки, примерно менее трех миллиметров в длину.
Очистите кусочки опухоли в трубку, и осторожно инвертировать трубку, пока все части погружены в пищеварение средств массовой информации. Перенесите трубку на встряхивающее устройство в течение 20 минут при 37 градусах по Цельсию, чтобы переварить. Убедитесь, что все части опухоли погружены в воду, а не застрял на краю трубки.
Сразу после шага пищеварения поместите трубку на лед, чтобы замедлить активность ферментов. Добавьте EDTA для достижения окончательной концентрации 20 миллимоляра, и кратко вихрь образца смешивать для того, чтобы дальнейшее замедление активности ферментов. Откройте трубку и промойте любой опухоли переварить с крышки трубки со свежей среды RPMI.
Затем приготовьте 70 микрон ситечко, поместите его на 50 миллилитров открытой трубки на льду. Предварительно промокнуть фильтр со средним. Resuspend переваренных клеток и мыть стороны трубки с помощью 25 миллилитров или больше Stripette.
Более широкое открытие Stripette позволяет толстый дайджест пройти легко. Перенесите весь дайджест на ситечко, используя 25-миллилитровый стриптиз. Размять вверх и вниз по опухоли в верхней части фильтра с помощью одного миллилитрового шприца поршень.
Непрерывно мыть клетки через ситечко с RPMI. Убедитесь в том, чтобы мыть с достаточной силой, чтобы подтолкнуть клетки до конца. Продолжайте мыть, пока все клетки не прошли через ситечко.
Центрифуга трубки в течение пяти минут при 300 раз G, и четыре градуса по Цельсию. Тщательно перерасходовать ячейки гранулы, и завершить RPMI, и пройти непосредственно через другой фильтр, чтобы удалить любые внеклеточные матрицы, или большие ячейки сгустки, которые не могут быть адекватно перерасход. Если стимуляция не требуется, немедленно испачкать изолированные клетки для анализа цитометрии потока, или повторно использовать их в замораживании среды 10%DMSO и FBS, и хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Для выполнения стимуляции сначала подсчитайте клетки. Разбавить клетки в полной среде для достижения концентрации в два раза десять до шести на 100 микролитров. Плита 100 микролитров клеток в каждом колодец U-bottomed 96 хорошо пластины.
Добавьте 100 микролитров полной среды, содержащих 2X препарат PMA, и иономицин. Поместите пластину в инкубатор при 37 градусах по Цельсию, но 5%Углекислый диоксид в течение одного часа. Затем, на 20 микролитров 10X подготовки Brefeldin A, и Monensin, и полный средств массовой информации для достижения окончательной концентрации 1,06 микромолара, и 2,0 микромолара, соответственно.
Положите тарелку обратно в инкубатор еще на четыре часа. После введения 1000 ТБ32048 клеток в поджелудочную железу, ортопедические опухоли занять около 30 дней, чтобы развиваться. После пищеварения и стимуляции собранных ортопедических опухолей, флуоресценция минус один был выполнен для определения фоновой флуоресценции для gating.
А Brefeldin A Monensin только контроль был выполнен для определения базального производства цитокинов. Для интерферон-гамма инкубации с Брефедин А и Моненсин, привело к увеличению интерферона гамма над FMO контроля, как в селезенке и опухоли образцов. Тем не менее, добавление PMA и иономицина, увеличило процент внутриклеточного интерферона гамма обнаруживается как в splenic и опухолевых полученных CD4 положительных и CD8 положительных Т-клеток.
Splenic CD4 положительные и CD8 положительные Т-клетки, используемые в качестве положительного контроля, имеют относительно более высокую выработку гамма-интерферона, чем опухолевые Т-клеточные подмножества. Указание иммуносупрессии происходит в опухоли. Используя ту же стратегию для TNF альфа, высокий процент splenic CD4 положительные Т-клетки были положительными для внутриклеточного TNF альфа.
По сравнению с опухолевым проникновением CD4 положительные Т-клетки. Splenic и опухолевых проникающих CD8 положительных Т-клеток, производится аналогичные уровни альфа-TNF. Убедитесь, что опухоль достаточно нарезанный, и что все части погружены в пищеварение средств массовой информации.
При затирания опухоли, убедитесь, что нежный, и мыть клетки через тщательно. Протокол пищеварения опухоли может быть объединен с сортировкой клеток с помощью потока, чтобы очистить отдельные подмножества иммунных клеток для дополнительного, функционального или анализа экспрессии генов. Мы использовали этот метод, чтобы охарактеризовать, как В-клетки формируют иммунный ответ во время рака поджелудочной железы, генерации ортопедических опухолей в обоих В-клеток нокаутом и B клеток истощенных мышей.
