Этот протокол обеспечивает воспроизводимые, иммунокомпетентные модели PDAC in vivo, подходящие для исследований генотипа, фенотипа и лекарственного ответа. Основным преимуществом этого метода является его способность помочь исследовать опухолевую прогрессию с сингенным биологическим микроокружением опухоли при сохранении воспроизводимости эксперимента. Продемонстрируют процедуру Стефани Бартель и Кьяра Фалькомата, обе из нашей лаборатории.
Начните подготовку опухолевых клеток с промывания аденокарциномы протоков поджелудочной железы или клеток PDAC, выращенных в колбе для культуры T75 с фосфатным буферным физиологическим раствором или PBS. Затем добавьте 0,5 миллилитра трипсина в течение пяти-10 минут, чтобы отсоединить от колбы. Повторно суспендируйте отделенные клетки в 10 миллилитрах DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой, или FBS, и 0,1% пенициллинового стрептомицина, прежде чем переносить клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку.
Центрифугируйте клеточную суспензию при 200 г в течение пяти минут и аспирируйте надосадочную жидкость. Повторно суспендировать гранулы клеток в DMEM без добавок, исходя из требуемой конечной концентрации клеток для инъекции. Подсчитайте клетки в 10 микролитрах клеточной суспензии, используя камеру Нейбауэра, и рассчитайте количество доступных клеток.
Перелейте один миллилитр разбавленной суспензии в соответствии с конечной требуемой концентрацией в пробирку объемом 1,5 миллилитра. Поместите трубку на ротатор до имплантации, чтобы предотвратить агрегацию клеток. Для ортотопической имплантации клеток PDAC нанесите крем для глаз на анальгоседированную мышь, пока мышь спит.
Проверьте достаточную анальгоседацию перед бритьем левого бокового брюшного бока анальгоседированной мыши. Положите мышь, лежащую на правом боку, на стерильный нагревательный коврик и приклейте лапки к поверхности. Наденьте новые перчатки и продезинфицируйте их.
С помощью хирургических ножниц отрежьте около одного сантиметра кожи и подкожно-жировой клетчатки в продольном направлении на левом боку, где выступает селезенка. С помощью ножниц и щипцов отделите кожу от брюшины, чтобы получить более легкий доступ к брюшине. Поменяйте ножницы перед вскрытием брюшины в месте расположения селезенки с продольным разрезом в один сантиметр.
Мобилизуя селезенку и прикрепленную поджелудочную железу с помощью тупых щипцов с тонкими наконечниками, убедитесь, что органы не прикреплены к другим тканям. Также проверьте кровоснабжение кровеносных сосудов, чтобы избежать травмирования сосудов или окружающих тканей при работе с поджелудочной железой. Осторожно вытащите поджелудочную железу из разреза, чтобы облегчить доступ к хвосту органа, и наблюдайте за селезенкой, следующей за поджелудочной железой.
Убедитесь, что орган не сложен во время инъекции, а капсула органа удерживается под натяжением в месте проникновения иглы, чтобы избежать утечки. Стремитесь к кусочку ткани поджелудочной железы между видимыми кровеносными сосудами, чтобы свести к минимуму риск прокола или инъекции сосуда. Доминирующей рукой осторожно проникните в капсулу органа с помощью канюли 27 калибра и шприца объемом 50 микролитров по продольной оси органа.
После введения 20 микролитров суспензии, содержащей 2 500 клеток, в хвостовую область поджелудочной железы держите поджелудочную железу и вставленный шприц неподвижно в течение примерно одной минуты, чтобы избежать разлива опухолевых клеток. Затем извлеките иглу из места инъекции. Затем осторожно переставьте органы внутри брюшной полости, не повреждая ткани, чтобы избежать разлива клеток.
Избегайте адгезии органов, вылив на органы один миллилитр 0,9% хлорида натрия. После наложения швов на брюшину с помощью простой техники прерывистого шва закройте кожу с помощью двух-трех девятимиллиметровых зажимов из нержавеющей стали. Затем антагонизируют анальгоседацию мидазоламом, медетомадином и фентанилом, или MMF, с помощью подкожной инъекции AFN в соответствии с массой тела мыши.
После этого поместите мышь в камеру с подогревом 37 градусов по Цельсию, пока она не проснется и не станет полностью активной. Поместите активную мышь обратно в исходную клетку и следите за состоянием здоровья мыши, проверяя шерсть, цвет кожи и активность, и повторите это через три-четыре часа после операции. При МРТ имплантированной мыши приживление клеток PDAC пальпировалось брюшной полостью примерно через семь дней после операции, в зависимости от количества введенных клеток, а также агрессивности и характеристик роста инокулированной клеточной линии.
Выживаемость полученных имплантированных мышей варьировалась в зависимости от особенностей опухолевых клеток, присущих клеточным линиям. Успешные внутрипанкреатические инъекции привели к полномасштабным опухолям в поджелудочной железе мыши. Напротив, неудачные имплантации приводили к отсутствию опухолей поджелудочной железы из-за инъекции нежизнеспособных клеток, отторжения имплантированных клеток или инъекции недостаточного количества клеток.
Не забывайте обращать внимание на то, чтобы не проливать клетки во время инъекций и не травмировать окружающие ткани, чтобы предотвратить распространение клеток внутри брюшной полости. Следуя этой процедуре, исследования in vivo, такие как доклинические исследования лекарственного ответа, могут быть выполнены на иммунокомпетентных мышах с последующими, например, факты, секвенирование или гистологический анализ для изучения взаимодействия опухолевого хозяина.
