Quindi il nostro modello permette lo studio della modulazione post-trascrizionale di una trascrizione specifica nelle cellule epiteliali alveolari nella coltura primaria e nelle loro condizioni fisiologiche e fisiopatofiche. Quindi la transitoria transitoria delle cellule epiteliali alveolari primarie ha un effetto minimo sulla fisiologia cellulare e sul metabolismo, il che pone un chiaro vantaggio rispetto ai protocolli classici usando gli inibitori della trascrizione. Per la generazione di un plasmide di risposta che esprime un gene di interesse, la sequenza del gene e i siti di clonazione multipla del vettore inducibile devono essere analizzati per identificare le sequenze di riconoscimento nei siti di clonazione multipla che non sono presenti internamente nel gene.
Utilizzando la taq polimerasi ad alta fedeltà e le tecniche PCR di sovrapposizione standard, affiancare il gene di interesse con due siti di riconoscimento enzimatico di restrizione selezionati utilizzando primer di progettazione. Una sequenza nella codifica dell'epitopo V5 a monte del gene di interesse deve essere inclusa per distinguere l'espressione del gene trasfetto dall'espressione endogena. I mutanti possono essere generati dalla cancellazione sequenziale per studiare gli effetti di diverse tre regioni prime non tradotte sulla stabilità dell'mRNA del gene usando primer inversi che codificano un sito di poliadenilazione che gradualmente elimina le tre estremità prime della regione non tradotta.
In definitiva, l'inserimento del gene di interesse può essere confermato dall'analisi delle restrizioni. L'orientamento genico e l'assenza di mutazioni potenzialmente introdotte durante l'rtPCR possono essere confermati sequenziando. Per la trasfezione del polmone del ratto primario di tipo due cellule epiteliali alveolari, seminare le cellule a una volta 10 alla sesta cellule per centimetro quadrato in piastre di Petri di 100 millimetri in presenza di un mezzo essenziale minimo completo.
Coltura per 24 ore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% con umidità. Il giorno dopo, aggiungere 500 microlitri di mezzo completo senza antibiotico ad ogni pozzo di una nuova piastra da 12 porri e preripidare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Durante questa incubazione, aggiungere un microgrammo del plasmide di risposta e un microgrammo di vettore regolatore a un tubo da 1,5 millilitri per pozzo.
Lavare le cellule epiteliali alveolari con 10 millilitri per pozzo di 37 gradi Celsius PBS senza calcio o magnesio e trattare le cellule con cinque millilitri per pozzo di 37 gradi Celsius 0,05% tripside per due o quattro minuti nell'incubatore di coltura cellulare. Quando le cellule si sono staccate, neutralizzare la tripina con 10 millilitri per pozzo di mezzo completo senza antibiotico e raccogliere le cellule in un nuovo tubo da 50 millilitri. Lavare il piatto con quattro millilitri di mezzo fresco per raccogliere eventuali cellule rimanenti e sedimentare le cellule mediante centrifugazione.
Resuspend il pellet in un millilitro di PBS per contare e centrifugare nuovamente le cellule. Resuspend il pellet ad una densità di quattro volte 10 alla settima cellule per millilitro di tampone di resuspensione e aggiungere quattro volte 10 alla quinta colonna ad ogni tubo di plasmide e vettore con miscelazione delicata. Posizionare un tubo nel dispositivo di elettroporazione e riempire il tubo con 3,5 millilitri di tampone elettrolitico.
Deprimere completamente il pistone per inserire una punta dell'elettrodo placcato oro in una pipetta e mescolare delicatamente il contenuto del tubo. Aspirare con cura le celle con una pipetta e inserire la pipetta nella stazione di elettroporazione fino a quando non si sente un suono di clic. Selezionare il protocollo di elettroporazione appropriato per le cellule epiteliali alveolari e premere Start sul touchscreen.
Immediatamente dopo la trasfezione, rimuovere la pipetta e trasferire le cellule in un unico pozzo della piastra pre-riscaldata di 12 pozza. Quando tutte le cellule sono state elettroporate e placcate, posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare, sostituendo il supernatante in ogni pozzo con un mezzo completo con antibiotici dopo due giorni. Il successo della trasfezione può essere confermato dall'espressione di EGFP osservata dalla microscopia a fluorescenza o dalla citometria del flusso usando un vettore di controllo.
Per inibire la trascrizione del gene di interesse, 72 ore dopo la trasfezione sostituiscono il supernatante con un millilitro per pozzo di mezzo completo integrato con un microgrammo per millilitro di adossiciclina appena preparata. Per valutare l'emidità dell'mRNA del gene di interesse, riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare da 15 minuti a sei ore. Lavaggio di un pozzo con un millilitro di PBS ghiacciato prima di lesinare le cellule con 500 microlitri di tampone di lysis da un kit di estrazione dell'RNA cloroformio fenolo disponibile in commercio e scuotimento delicato in ogni momento sperimentale.
Quindi, isolare l'RNA secondo le istruzioni del kit e determinare la resa e la purezza dell'RNA mediante spettrofotometria a 230, 260 e 280 nanometri. Per determinare la stabilità dell'RNA isolato, trattare prima un microgrammo dell'RNA totale da ogni campione con DNasi libera da RNasi uno per rimuovere eventuali tracce di DNA plasmide. Utilizzare un kit di sintesi cDNA disponibile in commercio con una miscela di primer oligo dT ed esomeri casuali per migliorare l'efficienza di trascrizione inversa per invertire il trascrivere l'RNA totale impoverito del DNA in cDNA secondo le istruzioni del produttore.
Aggiungere 180 microlitri di acqua di grado di biologia molecolare ai 20 microlitri del mix di reazione per diluire la reazione del cDNA a una concentrazione di cinque nanogrammi per microlitri e diluire immediatamente il mix di cDNA con acqua fresca di grado di biologia molecolare per raggiungere una concentrazione di 1,25 nanogrammi per microlitro. Combina cinque microlitri di mix principale di colorante verde cibernetico con 0,1 microlitri di acqua di grado di biologia molecolare, 0,45 microlitri di primer forward micromolare 7,5, 0,45 microlitri di primer inverso micromolare e quattro microlitri di 1,25 nanogrammi per microlitro di cDNA per ottenere un volume di reazione totale di 10 microlitri. Posizionare i campioni in un termociclometro qPCR e amplificare il gene di interesse del tag V5 e gli ampliconi anticipati del transattivo della tetrociclina utilizzando le condizioni qPCR come indicato e generare una curva di fusione ad alta risoluzione per valutare le temperature di fusione specifiche degli ampliconi desiderati e per garantire l'assenza di picchi di analcone acustico.
Questa tecnica di elettroporazione delle pipette facilita un tasso di efficienza di trasfezione dal 25 al 30%, come osservato dai rapporti delle cellule EGFP rilevati dalla microscopia a fluorescenza e dalla citometria del flusso. Il trattamento delle cellule epiteliali alveolari con un microgrammo per millilitro di doxiciclina non ha alcun impatto significativo sull'espressione dell'mRNA endogeno alfa ENaC in qualsiasi momento durante il periodo di trattamento. Utilizzando un sistema di espressione plasmide controllato trascrizioni come dimostrato, il segnale V5 alpha ENaC potrebbe essere normalizzato secondo il segnale avanzato del transattiator tetraciclina per determinare l'efficienza della trasfezione usando il metodo del ciclo di quantificazione a doppio delta.
L'emivita dell'mRNA alfa ENaC è fino a sette volte più breve in presenza del sistema di sconto tetraciclina rispetto alla presenza di actinomicina D, confermando che l'actinomicina D porta ad una stabilizzazione artefatto dell'mRNA alfa ENaC. Inoltre, il trattamento alfa del fattore di necrosi cicloesamide e tumorale ha diminuito significativamente la stabilità della trascrizione mentre i lipolisaccaridi no. Cambiamenti significativi nella modulazione della stabilità dell'mRNA V5 alpha ENaC possono essere indotti a seconda delle regioni cancellate e incluse delle tre regioni prime non tradotte.
Inoltre, l'espressione sovraescrizione di specifiche proteine leganti l'RNA diminuisce la stabilità dell'mRNA ENaC 5-alfa rispetto alla trasfezione con un pcDNA vuoto tre plasmidi. Questo strumento sarà utile per interrogare nuove intuizioni sulla regolazione post-trascrizionale dei geni chiave coinvolti nella funzione dell'epitelio alveolare e sulle loro condizioni fisiologiche o patologiche.
