Yani modelimiz, primer kültürdeki alveoler epitel hücrelerinde belirli bir transkriptin transkripsiyon sonrası modülasyonunun ve bunların fizyolojik ve patofizyolojik durumlarının incelenmesine olanak sağlar. Yani primer alveoler epitel hücrelerinin geçici transfeksiyonu hücre fizyolojisi ve metabolizmaları üzerinde minimal etkiye sahiptir, bu da transkripsiyon inhibitörlerini kullanan klasik protokollere göre açık bir avantaj sağlar. İlgi genini ifade eden bir yanıt plazmidinin üretimi için genin dizilimi ve indüklenebilir vektörün birden fazla klonlama alanı, gende dahili olarak bulunmayan birden fazla klonlama bölgesinde tanıma dizilerini belirlemek için analiz edilmelidir.
Yüksek sadakat tak polimeraz ve standart örtüşen PCR teknikleri kullanarak, tasarımcı astarları kullanarak iki seçilmiş kısıtlama enzim tanıma siteleri ile ilgi genini kuşatın. İlgi geninin V5 epitope upstream kodlama bir dizi endojen ifade transfected genin ekspresyonunu ayırt etmek için dahil edilmelidir. Mutantlar, çevrilmemiş bölgenin üç asal ucunu yavaş yavaş silen bir poliadenilasyon sitesini kodlayan ters astarlar kullanarak genin mRNA stabilitesi üzerindeki etkilerini incelemek için sıralı silme ile oluşturulabilir.
Sonuç olarak, ilgi geninin eklenmesi kısıtlama analizi ile doğrulanabilir. RtPCR sırasında potansiyel olarak tanıtılan gen oryantasyonu ve mutasyonların yokluğu sıralama ile doğrulanabilir. Birincil sıçan akciğer tipi iki alveoler epitel hücrelerintransfeksiyon için, tam minimum temel orta varlığında 100 milimetre Petri kapları santimetre kare başına altıncı hücrelere bir kez 10 hücreleri tohum.
37 santigrat derecede 24 saat boyunca nem oranı %5 karbondioksit. Ertesi gün, yeni bir 12 iyi plaka her iyi antibiyotik olmadan tam orta 500 mikrolitre ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derece plaka önceden ısıtın. Bu kuluçka sırasında, yanıt plazmid bir mikrogram ve düzenleyici vektör bir mikrogram iyi başına bir 1.5 mililitretüp ekleyin.
Kalsiyum veya magnezyum olmadan 37 santigrat derece PBS kuyu başına 10 mililitre ile alveoler epitel hücreleri yıkayın ve hücre kültürü kuluçka iki ila dört dakika boyunca 37 santigrat derece santigrat% 0.05 tripsin başına beş mililitre ile hücreleri tedavi. Hücreler ayrıldığında, antibiyotik olmadan tam orta kuyu başına 10 mililitre ile tripsin nötralize ve yeni bir 50 mililitre tüp içine hücreleri toplamak. Kalan hücreleri toplamak ve santrifüj ile hücreleri tortu taze orta dört mililitre ile çanak yıkayın.
Tekrar saymak ve tekrar santrifüj için PBS bir mililitre pelet resuspend. Resuspension tampon mililitre başına yedinci hücrelere dört kez 10 bir yoğunlukta pelet resuspend ve yumuşak karıştırma ile plazmid ve vektör her tüp için beşinci hücrelere dört kez 10 ekleyin. Elektroporasyon cihazına bir tüp yerleştirin ve tüpü 3,5 mililitre elektrolitik tamponile doldurun.
Bir pipet içine altın kaplama elektrot ucu eklemek ve yavaşça tüp içeriğini karıştırmak için tamamen piston depress. Hücreleri bir pipetle dikkatlice aspire edin ve bir tıklama sesi duyulana kadar pipeti elektroporasyon istasyonuna takın. Alveoler epitel hücreleri için uygun elektroporasyon protokolünü seçin ve dokunmatik ekranda Başlat tuşuna basın.
Transfeksiyondan hemen sonra pipeti çıkarın ve hücreleri önceden ısıtılmış 12 kuyuplakasının bir kuyuya aktarın. Tüm hücreler elektroporated ve kaplama olduğunda, iki gün sonra antibiyotikler ile tam orta ile her kuyuda supernatant yerine, hücre kültürü kuluçka plaka yerleştirin. Transfeksiyonun başarısı, floresan mikroskopi veya akış sitometrisi tarafından kontrol vektörü kullanılarak gözlenen EGFP ifadesi ile doğrulanabilir.
İlgi geninin transkripsiyonini inhibe etmek için, 72 saat post-transfection taze hazırlanmış adoksisiklin mililitre başına bir mikrogram ile takviye tam orta kuyu başına bir mililitre ile supernatant değiştirin. MRNA'nın yarı ömrünü faiz geninin yarı ömrünü değerlendirmek için plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine 15 dakikadan altı saate geri döndürün. Bir mililitre buz gibi pBS ile bir kuyu yıkama, hücreleri 500 mikrolitre lysis tamponu ile düzenli hale getirerek, her deneysel zaman noktasında ticari olarak mevcut olan fenol kloroform RNA ekstraksiyon kitinden hafifçe titretin.
Daha sonra, Kit talimatlarına göre RNA'yı izole edin ve 230, 260 ve 280 nanometrede spektrofotometri ile RNA verimini ve saflığını belirleyin. İzole RNA'nın stabilitesini belirlemek için, ilk olarak her numuneden toplam RNA'nın bir mikrogramını rna içermeyen DNase ile tedavi edin ve plazmid DNA izlerini çıkarın. Üreticinin talimatlarına göre DNA tükenmiş toplam RNA ters transkripsiyon verimliliğini artırmak için oligo dT ve rasgele heksomer astar karışımı ile ticari olarak kullanılabilir cDNA sentez kiti kullanın.
Mikrolitre konsantrasyonu başına beş nanogramdaki cDNA reaksiyonunu seyreltmek için reaksiyon karışımının 20 mikrolitresine 180 mikrolitre moleküler biyoloji sınıfı su ekleyin ve mikrolitre konsantrasyonu başına 1,25 nanograma ulaşmak için cDNA karışımını taze moleküler biyoloji sınıfı suyla seyreltin. Moleküler biyoloji sınıf su 0.1 mikrolitre ile siber yeşil boya ana karışımı beş mikrolitre birleştirin, 0.45 mikrolitre 7.5 mikromolar ileri astar, 0.45 mikrolitre 7.5 mikromolar ters astar, ve cDNA 1.25gram perlitre toplam reaksiyon hacmi elde etmek için cDNA dört mikrolitre. Numuneleri bir qPCR termocycler'ına yerleştirin ve v5 etiket genini güçlendirin ve belirtildiği gibi qPCR koşullarını kullanarak tetrosikline transaktivatör avans amplikonlarını yükseltin ve istenilen amperatörlerin spesifik erime sıcaklıklarını değerlendirmek ve gürültü amplicon tepelerinin yokluğunu sağlamak için yüksek çözünürlüklü erime eğrisi oluşturun.
Bu pipet elektroporasyon tekniği, floresan mikroskobu ve akış sitometrisi ile saptanan EGFP hücrelerinin oranlarında gözlendiği gibi %25-30 transfeksiyon verimlilik oranını kolaylaştırır. Doksisiklin mililitre başına bir mikrogram ile alveoler epitel hücrelerinin tedavisi tedavi süresi boyunca herhangi bir zaman noktasında endojen alfa ENaC mRNA ekspresyonu üzerinde önemli bir etkisi yoktur. Gösterildiği gibi transkripsiyonla kontrol edilen plazmid ekspresyon sistemi kullanılarak, V5 alfa ENaC sinyali tetrasiklin transaktivatör gelişmiş sinyaline göre normalleştirilebilmekte ve çift delta niceleme döngüsü yöntemi kullanılarak transfeksiyonun etkinliğini saptamak gerekir.
Alfa ENaC mRNA'nın yarılanma ömrü, tetrasiklin insiyatifinin varlığında, aktinomisin D'nin artifreal alfa ENaC mRNA stabilizasyonuna yol açtığını doğrulayan, tetrasiklin inin insiyatifinin varlığında yedi kata kadar daha kısadır. Ayrıca siklohexamide ve tümör nekroz faktör alfa tedavisi transkriptin stabilitesini önemli ölçüde azaltırken lipopolisakkaritler azalmaz. V5 alfa ENaC mRNA stabilitesi modülasyonunda önemli değişiklikler üç asal çevrilmemiş bölgenin silinmiş ve dahil bölgelere bağlı olarak indüklenebilir.
Buna ek olarak, spesifik RNA bağlayıcı proteinlerin aşırı ekspresyonu boş bir pcDNA üç plazmid ile transfeksiyon ile karşılaştırıldığında 5-alfa ENaC mRNA kararlılığını azaltır. Bu araç, alveoler epitelin işlevi ve bunların fizyolojik veya patolojik koşulları ile ilgili anahtar genlerin transkripsiyon sonrası düzenlenmesi ne yeni anlayışlar sorgulamak için yararlı olacaktır.
