因此，我们的模型允许研究原培养中起白细胞中特定转录的转录后调制及其生理和病理生理条件。因此，原发性alvelar上皮细胞的瞬态转染对细胞生理和代谢的影响最小，与使用转录抑制剂的经典方案不同，具有明显的优势。为了产生表达感兴趣基因的响应质粒，必须分析该基因的序列和可受骗载体的多个克隆位点，以确定基因内部不存在的多个克隆位点中的识别序列。
使用高保真 taq 聚合酶和标准重叠 PCR 技术，使用设计底像使用两个选定的限制性酶识别位点对感兴趣的基因进行侧翼处理。必须包括编码感兴趣基因上游V5表位序列，以区分转染基因与内源性表达的表达。突变体可以通过顺序删除来研究不同三个未翻译的正向区域对基因mRNA稳定性的影响，使用编码聚亚亚二聚亚化站点的反向底像，逐渐删除未翻译区域的三个主要端。
最终，通过限制分析可以确认感兴趣的基因的插入。基因取向和在rtPCR期间可能引入的突变的缺失可以通过测序得到确认。对于原发性大鼠肺二型肺上皮细胞的转染，在100毫米培养皿中，以每平方厘米10至6个细胞的1倍至6个细胞在完全最低基本介质的情况下播种细胞。
培养24小时在37摄氏度的5%二氧化碳与湿度。第二天，在一个新的12井板的每个井中加入500微升无抗生素的完全介质，并在37摄氏度下预热板30分钟。在孵育过程中，将一微克的反应质粒和一微克的调节载体添加到每井1.5毫升管中。
在不加钙或镁的情况下，用每井10毫升的上皮细胞清洗，不带钙或镁，用每井5毫升0.05%的三头肌在细胞培养箱中治疗5毫升，每井0.05%的三头肌素2至4分钟。当细胞分离后，用每井10毫升的滴答声中和没有抗生素的，并收集细胞到一个新的50毫升管。用四毫升新鲜培养剂清洗盘子，收集任何剩余的细胞，通过离心沉淀细胞。
将颗粒重新在一毫升 PBS 中，用于计数并再次离心细胞。将颗粒以每毫升再增缓冲液的四倍10的密度重新填充至第七细胞，并将四乘以十十的颗粒添加到每管质粒和载体中，并轻轻混合。将一根管子放在电穿孔装置中，用3.5毫升电解缓冲液填充管子。
完全按下活塞，将镀金电极尖端插入移液器中，然后轻轻混合管内侧。小心地用移液器吸气细胞，并将移液器插入电穿孔站，直到听到咔嗒声。选择对起白体上皮细胞的适当电穿孔方案，然后按触摸屏上的"开始"。
转染后立即取出移液器，将细胞转移到预热的12个井板的一个井中。当所有细胞都经过电分和镀，将板放在细胞培养培养箱中，在两天后用抗生素取代每井中的上经剂和完整的培养剂。通过荧光显微镜或流式细胞学使用对照载体观察到的EGFP的表达可以证实转染的成功。
为了抑制感兴趣的基因的转录，转染后72小时用全米每井一毫升代替上流水，并辅以每毫升新鲜准备的副氧环素一微克。要评估感兴趣的基因的mRNA半寿命，将板返回细胞培养箱，从15分钟到6小时。用一毫升冰冷PBS洗好一口，然后用500微升的解液缓冲液从市售的酚氯仿RNA提取试剂盒中解压细胞，并在每个实验时间点轻轻摇动。
然后，根据试剂盒指令分离RNA，通过230、260和280纳米的分光光度测量确定RNA的屈服度和纯度。要确定分离的RNA的稳定性，首先用无RNase无DNase一个来治疗每个样品中总RNA的一微克，以去除任何质粒DNA痕迹。使用市售的cDNA合成试剂盒，混合寡聚dT和随机六分位体底转，提高逆转录效率，根据制造商的说明将DNA耗尽的总RNA反向转录到cDNA中。
将180微升分子生物级水加入反应混合物的20微升，以每微升浓度5南克稀释cDNA反应，并立即用新鲜分子生物学级水稀释cDNA混合物，达到每微升浓度1.25纳克。将网络绿色染料主混合5微升与分子生物学级水0.1微升、0.45微升7.5微摩尔前底、0.45微升7.5微摩尔反向底头、4微升（每微升cDNA）1.25纳米微升相结合，获得10微升的总反应量。将样品放在 qPCR 热循环器中，并使用指示的 qPCR 条件放大感兴趣的 V5 标记基因和四环素转活器推进安普利子，并生成高分辨率熔化曲线，以评估所需安普利翁的特定熔化温度，并确保没有噪声放大器峰值。
这种移液器电穿孔技术可提高25-30%的转染效率，如荧光显微镜和流式细胞学检测的EGFP细胞的比例。在治疗期间的任何时间点，用每毫升多西环素一微克治疗的alvelar上皮细胞对内源性α Α RNA MRNA的表达没有显著影响。使用所演示的转录控制质粒表达系统，V5 alpha ENaC信号可以根据四环素转活器高级信号进行规范化，使用双增量定量循环方法确定转染效率。
在四环素离系统的情况下，α ENaC mRNA 的半寿命比在四环素离系统存在时短七倍，这证实了阿提诺霉素 D 导致伪阿尔法 ENaC mRNA 稳定。此外，环异酰胺和肿瘤坏死因子α治疗显著降低了转录本的稳定性，而脂质多糖则不然。V5 alpha ENaC mRNA 稳定性的调制可根据三个未翻译区域的删除和包含区域而诱发显著变化。
此外，与空PCDNA三质粒的转染相比，特定RNA结合蛋白的过表达会降低5-αENaC mRNA的稳定性。此工具将有助于查询对参与起维骨上皮功能及其生理或病理状况的关键基因的转录后调控的新见解。
