Высокопроизводительный скрининговый флуоресцентный анализ кальция с двойным добавлением позволяет идентифицировать новые лиганды малых молекул рецептора, связанного с G-белком, который сигнализирует через внутриклеточный каскад кальция. Основным преимуществом двойного дополнительного анализа является обнаружение агониста и антагониста HTS в одном анализе с одними и теми же ячейками при условии, что флуоресцентный сигнал длится две минуты. Этот метод может быть применен к любому GPCR, который сигнализирует через кальциевый каскад, который включает в себя большую часть семейства пептидов нейронов членистоногих, GPCR.
Для воспроизводимости анализа важно оптимизировать плотность клеток, скорость инъекции и концентрацию известного агониста для второго издания. Продемонстрировать процедуру будет Бьянка Энрикес-Сантос, научный сотрудник моей лаборатории. Начните анализ флуоресценции кальция, удалив отработанную среду из колбы Т-75, содержащей от 70 до 90% сливающихся трех клеток BMLK.
Промыть клетки 10 миллилитрами фосфатно-буферного физиологического раствора Dulbecco или DPBS. После удаления DPBS отсоедините клетки с помощью двух миллилитров 0,25% трипсина этилендиаминтетрауксусной кислоты или ЭДТА и инкубируйте в течение трех-пяти минут при 37 градусах Цельсия. Добавьте восемь миллилитров селективной среды и переведите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 миллилитров.
Перед центрифугированием ячейка суспензии по 1000 х г в течение трех минут. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 миллилитрах среды F-12K, содержащей 1% фетальной бычьей сыворотки или FBS и 400 мкг на миллилитр сульфата G418. Чтобы определить плотность ячейки суспензии для дальнейшего разбавления, смешайте 20 микролитров клеточной суспензии в 20 микролитра 0,4% трипанового синего цвета, а затем загрузите 20 микролитров смеси в камеру подсчета клеток для считывания счетчиком клеток на плотность клеток.
Разбавляют клеточную суспензию с использованием той же среды F-12K и составляют конечный объем до 15 миллилитров при плотности от четырех раз 10 до пятой ячейки на миллилитр. Для посева клеток в Поли-D лизин или PDL кодируется 384 скважинная пластина. Добавьте 25 микролитров разбавленной клеточной суспензии в 384 скважины пластины с помощью системы обработки жидкости.
Инкубируйте пластину на ночь при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в увлажненном инкубаторе. На следующий день быстро инвертируйте 90%-ную сливающуюся 384 луночную плиту. Удалить отработанную среду и аккуратно промокнуть на стерильных бумажных полотенцах два-три раза, чтобы удалить всю жидкость с тарелки.
Выполните следующие шаги в мягком тусклом свете внутри шкафа биобезопасности. Затем добавьте 25 микролитров загрузочного красителя в каждую скважину с помощью системы обработки жидкости, дозируя 12,5 микролитров в каждую скважину с аспирацией и скоростью дозирования 3,8 микролитра в секунду. Повторите этот этап пипетки, чтобы достичь конечного объема в 25 микролитров в каждой скважине.
После этого накройте пластину алюминиевой фольгой, чтобы защитить ее от окружающего света, и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в увлажненном инкубаторе углекислого газа в течение 30 минут. После уравновешивания покрытой пластины еще на 30 минут ячейки готовы к высокопроизводительному скринингу или HTS. Далее центрифугируют лекарственную пластину при 1200 х г в пластинчатой центрифуге в течение одной минуты.
Переложите 10-кратный агонистический пептидный раствор Rhimi-K-1 в 150-миллилитровый авто-дружественный резервуар. В устройстве чтения пластин щелкните Управление протоколами. Затем в протоколе интенсивности флуоресцентной жидкости конечной точки выберите Предварительное чтение Flow Forte, нажмите начать измерение, чтобы измерить фоновый сигнал для всего анализа HTS.
Вставьте ячейку пластины в устройство чтения пластин. На панели приборов нажмите на случайный колодец на пластине, затем нажмите на новую высоту фокусировки. Нажмите на настройку фокуса.
Нажмите на регулировку усиления. Назначьте его как от 5% до 10% от максимального измеримого значения флуоресценции. Нажмите кнопку Начать настройку.
Нажмите кнопку Начать измерение, чтобы прочитать всю пластину для фонового флуоресцентного сигнала в относительных флуоресцентных блоках или РФС. Во время чтения пластины щелкните текущее состояние, чтобы увидеть значение чтения в реальном времени. Для анализа с двойным добавлением пипетку 10 микролитров раствора лекарственного средства вверх и вниз три раза с использованием жидкостной системы обработки и аспирируют по 1,5 микролитра из каждой лунки лекарственной пластины со скоростью аспирации 1,0 микролитра в секунду.
Дозируют 0,5 микролитра соединений в клеточный анализ для достижения конечной концентрации двух микромоляров в 0,2% диметилсульфоксида или ДМСО. После добавления просеивающих соединений поместите пробирную пластину сразу же в считыватель пластин. Нажмите на предустановленную программу чтения и прочитайте пластину в направлениях прямого и обратного чтения.
Утилизируйте один микролитр раствора лекарственного средства, оставшегося в наконечниках, погружая наконечники в резервуар для отходов объемом 150 миллилитров, содержащий примерно 50 миллилитров DPBS. Инкубируйте просеивающие соединения с клетками в общей сложности пять минут, включая время внутри считывателя пластин в шкафу биобезопасности с выключенным светом. Затем добавьте три микролитра пептида агониста Rhimi-K-1 из резервуара в пробирную пластину с помощью системы обработки жидкости с использованием наконечников 384 12,5 микролитров.
Немедленно поместите пластину в устройство считывания пластин. Нажмите на предустановленную программу чтения и прочитайте пластину в направлениях прямого и обратного чтения. После этого вручную рассчитайте Z'factor для контроля качества каждого пластинчатого анализа.
Вручную выберите молекулы удара из тепловых карт на онлайн-платформе данных HTS и рассчитайте нормализованный процент активации или NPA и ингибирующей активности, или I0 для ударов агониста и антагониста. Для демонстрации этого анализа HTS была использована собственная лекарственная пластина SAC2-34-6170, состоящая из 320 случайных малых молекул. HTS имел отличное качество анализа с Z'множителем 0,7, отражающим, что качество анализа не зависит от тестируемых соединений.
Важно считывать пластину сразу после добавления агониста, потому что флуоресцентный сигнал недолговечен. После этой процедуры идентифицированная молекула попадания должна быть проверена с помощью анализов дозового ответа и протестирована в клетках, которые не экспрессируют целевой GPCR, чтобы исключить попадания вне цели.
