Наша простая и практичная методология может быть использована для получения обильных ADSCS для изучения PVAT adipogenesis in vitro и для тестирования нормальных препаратов против ожирения и связанных с ним сердечно-сосудистых заболеваний. Преимуществом этого метода является присущая флуоресценции NCADSCs биотина вам нужно пометить клетки с flou-хромом конъюгированных антител для FACS, или магнитной активированной сортировки клеток. Этот метод может быть использован для приобретения обильных ADSC, полученных из нейронных клеток гребня из эктодерма для изучения PVAT адипогенез, или липогенез в пробирке.
Использование молодых мышей и наличие опыта работы с прижиганием и индуцированным адипогенезом означает, что клетки 3T3 имеют решающее значение для успеха этого протокола. Демонстрация процедуры будет Yiding Ци, аспирант, и Лиан Сюй, техник из моей лаборатории. Для вскрытия PAAT, после стерилизации туши мыши в 75% этанола в течение пяти минут, используйте ножницы, чтобы отрезать и отделить кожу на животе.
Вырезать вдоль брюшной средней линии от таза до шеи, и открыть живот. Перемести печень, чтобы разоблачить диафрагму, и вырезать диафрагму и ребра по обе стороны от средней линии. Очистите ребра, чтобы разоблачить сердце и легкие.
И удалить легкие и тимус. Извлекайте PAAT вместе с аортой и сердцем в чашку Петри. И отрезать аорту у корня аорты, чтобы удалить сердце.
Затем сделайте разрез между аркой аорты и нисходящей аортой. Тщательно отделить жировой ткани, окружающие обе структуры, и левой и правой общих сонных артерий от задней стенки грудной клетки. Важно отделить PAAT от корня и, как большие сосудистые сосуды тщательно, является наличие сосудистых клеток стенки может повлиять на эффективность FACS.
Поместите ткань в чашку Петри, содержащую ледяной буфер HBSS. И использовать стерильные типсы, чтобы удалить как можно больше сосудов и фасции, как это возможно. Затем перенесите жировую ткань в двухми миллилитровую трубку Эппендорфа, содержащую пять миллилитров ледяного буфера HBSS на льду.
Когда все PAAT были собраны, передать собранные жировой ткани в новый два миллилитров микро-центрифуги трубки, содержащей один миллилитр свежеприготовленной среды пищеварения. И использовать хирургические ножницы, чтобы фарш тканей. Перенесите навоз ткани в 50-миллиметровую трубку, содержащую девять миллилитров свежей среды пищеварения.
И использовать один миллилитр пипетки тритурировать ткани 10 раз. Когда однородный раствор был получен, инкубировать трубку в течение 30 до 45 минут при 37 градусов по Цельсию и 100 оборотов в минуту, проверяя каждые пять-десять минут, чтобы предотвратить переварение желудка. Когда светло-желтый однородный раствор жировой ткани можно наблюдать при нежном закручении трубки, остановите пищеварение с пятью миллилитров HDMEM, дополненными 10%фетальной сывороткой крупного рогатого скота.
После тщательного смешивания центрифуга образца жировой ткани. Стромальная сосудистая клеточная фракция будет видна как коричневатые гранулы. Повторно приостанавливайте гранулы в 10 миллилитров среды культуры и фильтруйте подвеску клетки через 70-метровый клеточный ситечко.
Соберите клетки другой центрифугации. И осторожно повторно приостановить гранулы в пять миллилитров эритроцитов лиза буфера. Перенесите подвеску на 15-миллилитровую трубку.
Через 10 минут прекратите реакцию двумя центрифугами в 10 миллилитров PBS, дополненных сывороткой из крупного рогатого скота 1%. После второй центрифугации, повторно приостановить гранулы в пять миллилитров культуры среды на льду. И собирать клетки с окончательной центрифугации.
Затем повторно приостанавливают ячейки в пяти миллилитров буфера FACS для подсчета. Чтобы создать культуру NCADSC, после их изоляции FACS в соответствии со стандартными протоколами, поместите клетки в пять раз от 10 до третьих клеток на сантиметр в квадрате концентрации в каждой хорошо, двенадцать хорошо культуры пластины. Неполная среда культуры при 37 градусах По Цельсию и 5%углекислый газ в течение 20-24 часов.
На следующий день, мыть клетки с 37 градусов по Цельсию PBS, и кормить культуру со свежей среде культуры. Когда культура достигает 80 до 90% слияния, лечить клетки с двумя миллилитров 0,25%трипсина ЭДТА на колодец в течение трех-пяти минут при 37 градусов по Цельсию. Когда клетки были отделены от нижней части пластины, нейтрализовать ферменты с двумя миллилитров культурной среды, и собирать собранные клетки центрифугации.
Повторно приостанавливайте гранулы в один миллилитр свежей культуры среды для подсчета. И семян клеток в новой 12 хорошо культуры пластины в пять раз от 10 до третьих клеток на сантиметры в квадрате концентрации. Затем повторно приостанавливать оставшиеся клетки в среде культуры, дополненные 10%диметилсульфоксидом для замороженного хранения в жидком азоте.
Чтобы вызвать адипогенную дифференциацию, когда клетки достигают 80 до 90% слияния, лечить клетки с коричневой или белой адипогенной индукционной среды в течение двух дней по мере необходимости. В конце инкубации, аккуратно мыть клетки два раза с PBS, прежде чем добавить соответствующие свежие адипогенные индукции среды для каждого хорошо, и возвращение клеток в инкубатор культуры клеток в течение дополнительных трех-пяти дней инкубации. Культурные NCADSCs достичь 80 до 90% слияния после семи-восьми дней культуры.
И продемонстрировать расширенный стекловолокна, как морфология. Для дальнейшего подтверждения их адипогенного потенциала, масляное красное окрашивание дифференцированных NCADSCs может быть выполнено для обнаружения зрелых адипоцитов. Как правило, зрелые адипоциты наблюдаются после восьми дней белой или коричневой адипогенной индукции с более чем 60% NCADSCs выставке адипогенной дифференциации.
Обратите внимание, что NCADSCs демонстрируют значительно сниженный адипогенный потенциал после прохода. Иммуноблоттинг и количественные ПЦР в реальном времени показывают, что экспрессия адипоцитов специфических относительных белков и генов значительно увеличивается в адипогенически дифференцированных NCADSCs после восьми дней белой адипогенной индукции. Аналогичным образом, экспрессия адипоцитов конкретных генов, и коричневый адипоцитов конкретных генов, также значительно увеличивается после восьми дней коричневой адипогенной индукции.
Поскольку большинство протоколов изоляции NCADSC прост, экономичен и не требует использования антител, для этого, сильная интенсивность жидкости причин IFP может улучшить эффективность питания FACS.
