Unsere einfache und praktische Methodik kann verwendet werden, um reichlich ADSCS für die Untersuchung der PVAT-Adipogenese in vitro und den Test normaler Medikamente gegen Fettleibigkeit und damit verbundene Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu erhalten. Der Vorteil dieser Methode ist die inhärente Fluoreszenz der NCADSCs von Biotin, die Sie benötigen, um die Zellen mit flou-chrom konjugierten Antikörpern für FACS oder magnetisch aktivierte Zellsortierung zu kennzeichnen. Diese Methode kann verwendet werden, um reichlich ADSC aus neuronalen Kammzellen aus dem Ektoderm zu erwerben, um PVAT-Adipogenese oder Lipogenese in vitro zu untersuchen.
Die Verwendung junger Mäuse und Die Erfahrung mit Kauterie und induzierter Adipogenese bedeutet, dass 3T3-Zellen entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls sind. Demonstriert wird das Verfahren von Yiding Qi, einem Grad-Studenten, und Lian Xu, einem Techniker aus meinem Labor. Für DIE PAAT-Sektion, nach der Sterilisation der Maus Kadaver in 75%Ethanol für fünf Minuten, verwenden Sie eine Schere zu schnippen und trennen Sie die Haut auf dem Bauch.
Schneiden Sie entlang der ventralen Mittellinie vom Becken bis zum Hals, und öffnen Sie den Bauch. Bewegen Sie die Leber, um das Zwerchfell freizulegen, und schneiden Sie das Zwerchfell und die Rippen auf beiden Seiten der Mittellinie. Schälen Sie die Rippen zurück, um das Herz und die Lunge freizulegen.
Und entfernen Sie die Lunge und den Thymus. Extrahieren Sie die PAAT zusammen mit der Aorta und herz in eine Petrischale. Und schneiden Sie die Aorta an der Aortenwurzel ab, um das Herz zu entfernen.
Dann machen Sie einen Schnitt zwischen dem Aortenbogen und absteigenden Aorta. Trennen Sie vorsichtig das Fettgewebe, das beide Strukturen umgibt, und die linken und rechten gemeinsamen Karotisarterien von der hinteren Brustwand. Es ist wichtig, die PAAT von der Wurzel zu trennen und als größere Gefäßgefäße sorgfältig, ist das Vorhandensein von Gefäßwandzellen können FACS Effizienz beeinflussen.
Legen Sie das Gewebe in eine Petrischale mit eiskaltem HBSS-Puffer. Und verwenden Sie sterile Zangen, um so viel von der Vaskulatur und Faszie wie möglich zu entfernen. Dann übertragen Sie das Fettgewebe in eine zwei Milliliter Eppendorf-Röhre, die Punkt fünf Milliliter eiskalten HBSS-Puffer auf Eis enthält.
Wenn alle PAAT gesammelt wurden, übertragen Sie das geerntete Fettgewebe in ein neues Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr, das ein Milliliter frisch zubereitetes Verdauungsmedium enthält. Und verwenden Sie chirurgische Schere, um das Gewebe zu zerkleinern. Übertragen Sie die Gewebeschlämme in ein 50-Millimeter-Rohr mit neun Millilitern frischem Verdauungsmedium.
Und verwenden Sie eine 1 Milliliter Pipette, um das Gewebe 10 Mal zu triturat. Wenn eine homogene Lösung erhalten ist, inkubieren Sie die Röhre für 30 bis 45 Minuten bei 37 Grad Celsius und 100 Umdrehungen pro Minute, und überprüfen Sie alle fünf bis zehn Minuten, um Überverdauungen zu verhindern. Wenn eine hellgelbe homogene Fettgewebelösung beim sanften Wirbeln der Röhre beobachtet werden kann, stoppen Sie die Verdauung mit fünf MilliliterhdMEM, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum.
Zentrifugieren Sie nach einer gründlichen Mischung die Fettgewebeprobe. Die stromale Gefäßzellfraktion wird als bräunliches Pellet sichtbar sein. Setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter Kulturmedium wieder auf und filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb.
Sammeln Sie die Zellen durch eine andere Zentrifugation. Und das Pellet vorsichtig in fünf Milliliterer Erythrozyten Lysepuffer wieder aufhängen. Übertragen Sie die Suspension auf ein 15 Milliliter Rohr.
Nach 10 Minuten, stoppen Sie die Reaktion mit zwei Zentrifugationen in 10 Milliliter PBS, ergänzt mit 1%fetalem Rinderserum. Nach der zweiten Zentrifugation das Pellet in fünf MilliliterKulturmedium auf Eis wieder aufhängen. Und sammeln Sie die Zellen mit einer abschließenden Zentrifugation.
Setzen Sie dann die Zellen in fünf Milliliter FACS-Puffer für die Zählung erneut aus. Um eine NCADSC-Kultur einzurichten, nach ihrer Isolierung durch FACS nach Standardprotokollen, platzieren Sie die Zellen bei einer fünfmal 10 bis dritten Zelle pro Zentimeter quadratischer Konzentration in jedem Brunnen, einer zwölf Brunnenkulturplatte. Unvollständiges Kulturmedium bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 20 bis 24 Stunden.
Am nächsten Tag die Zellen mit 37 Grad Celsius PBS waschen und die Kultur mit frischem Kulturmedium füttern. Wenn die Kultur 80 bis 90% Konfluenz erreicht, behandeln Sie die Zellen mit zwei Millilitern von 0,25%Trypsin EDTA pro Brunnen für drei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Wenn die Zellen von der Unterseite der Platte gelöst wurden, neutralisieren Sie die Enzyme mit zwei Millilitern kultivierten Mediums und sammeln Sie die geernteten Zellen durch Zentrifugation.
Das Pellet in einem Milliliter frischem Kulturmedium zum Zählen wieder aussetzen. Und säen Sie die Zellen in einer neuen 12 Brunnenkulturplatte in einer fünfmal 10 bis dritten Zelle pro Zentimeter quadratische Konzentration. Dann, wieder aussetzen die verbleibenden Zellen in Kulturmedium mit 10%Dimethylsulfoxid für die gefrorene Lagerung in flüssigem Stickstoff ergänzt.
Um eine adipogene Differenzierung zu induzieren, behandeln die Zellen, wenn sie eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreichen, die Zellen mit braunem oder weißem adipogenem Induktionsmedium für jeweils zwei Tage. Am Ende der Inkubation die Zellen zwei Mal mit PBS vorsichtig waschen, bevor Sie jedem Brunnen das entsprechende frische adipogene Induktionsmedium hinzufügen und die Zellen für weitere drei bis fünf Tage in kubisch in den Zellkultur-Inkubator zurückbringen. Kultivierte NCADSCs erreichen nach sieben bis acht Tagen Kultur eine Konfluenz von 80 bis 90 %.
Und zeigen eine erweiterte Fiberglas-ähnliche Morphologie. Um ihr adipogenes Potenzial weiter zu bestätigen, können ölrote Färbungen der differenzierten NCADSCs durchgeführt werden, um reife Adipozyten zu erkennen. Typischerweise werden reife Adipozyten nach acht Tagen weißer oder brauner adipogenicr Induktion beobachtet, wobei über 60% der NCADSCs eine adipogene Differenzierung aufweisen.
Beachten Sie, dass NCADSCs nach dem Passaging ein stark reduziertes adipogenes Potenzial nachweisen. Immunoblotting und quantitative Echtzeit-PCR zeigen, dass die Expression von adipozyten spezifischen relativen Proteinen und Genen bei adipogen differenzierten NCADSCs nach acht Tagen weißer adipogener Induktion signifikant zunimmt. In ähnlicher Weise nimmt die Expression von adipozytenspezifischen Genen und braunen Adipozyten-spezifischen Genen auch nach acht Tagen brauner adipogener Induktion signifikant zu.
Da die meisten NCADSC-Isolationsprotokolle einfach, wirtschaftlich und nicht den Einsatz von Antikörpern erfordern, kann die starke Flüssigkeitsintensität von IFP die Ernährungseffizienz von FACS verbessern.
