Этот протокол может четко дифференцировать режимы смерти макрофагов клеток во время микобактериальной инфекции. Наблюдая несколько эмбрионов параллельно, это значительно увеличивает вероятность захвата всего процесса смерти литических клеток макрофагов. Этот протокол также может быть применен к наблюдению за гибелью клеток и другим клеточным поведением в аналогичных сценариях, связанных с инфекцией или стерильным воспалением.
Во время расширенной живой визуализации, это очень важно, чтобы сохранить интенсивность лазера как можно меньше, чтобы избежать фотоблейблинга и токсичности. После прививки в соответствии с рукописью, центрифуга культуры в 3000 раз G в течение 10 минут, чтобы собрать Mycobacterium маринум в качестве гранулы. Отбросьте все, кроме 300 микролитров супернатанта, и повторно приостановьте гранулы.
Добавить три миллилитров 7H9 среды с 10%glycerol для дальнейшего повторного приостановления гранулы, а затем sonicate подвески в водяной бане на 100 Вт, с 15 секунд и 15 секунд, в общей сложности две минуты для достижения одной клетки гомогената. Перенесите бактериальную суспензию на 10 миллилитровый шприц и пройдите через фильтр из пяти микрон, чтобы удалить любые бактериальные сгустки. Используя спектрофотометр, измерьте оптическую плотность подвески и разбавьте ее 7H9 средствами, содержащими 10%глицерол до OD 600 на одном.
Разделите подвеску на 10 микролитров алицитов и храните при отрицательных 80 градусах по Цельсию морозильную камеру для дальнейшего использования. Во-первых, тепла агарозы в 95 градусов по Цельсию тепловой блок, пока он полностью не расплавится. Поддерживайте агарозу в жидком виде, помещая ее в нагревательный блок 45 градусов по Цельсию.
Чтобы смонтировать для внутримышечной инфекции в области ствола, создать нижний слой агарозы путем заливки 0,5 миллилитров 1%weight по объему агарозы равномерно на стеклянную горку. Поместите слайд на холодильник или холодную поверхность в течение трех минут, чтобы укрепить. После анестезии эмбрионов зебры, поместите до 60 эмбрионов зебры на нижний слой агарозы, и выложить их тщательно в два ряда.
Удалите оставшуюся воду на нижний слой агарозы с помощью тканевой бумаги, прежде чем добавить 0,3 миллилитров весом 0,5%по объему агарозы для создания верхнего слоя. Убедитесь, что эмбрионы полностью встроены в агарозу. Верните стеклянную горку в ледяную коробку снова, чтобы затвердеть агарозу.
Держите верхний слой агарозы влажным, покрывая поверхность дополнительной яичной водой E3. Затем отрегулируйте микроинъектор и микроманипулятор в нужное положение и настройку для микроинъекции. Перенесите три микролитров подготовленной бактериальной культуры в подготовленную иглу с помощью микрозагрузчика.
Пипетт медленно и осторожно, чтобы избежать формирования пузырьков воздуха. Ввись 100 CFU в область ствола. После микроинъекции, тщательно промыть эмбрионы рыб зебры в пресную яичную воду с пластиковой пипеткой.
Чтобы смонтировать для инфекции среднего браина, используйте пластиковую пипетку для передачи от четырех до шести трикаин-анестезиологизированных эмбрионов в агарозу. Распоить головку каждого эмбриона вверх с помощью 10-го калибра иглы. Как только все позиции эмбрионов будут зафиксированы, перенесите стеклянную горку в ледяную коробку или холодную поверхность, чтобы агароза затвердела.
Ввись 500 CFU в середине браина. После микроинъекции, тщательно промыть эмбрионы зебры в пресную яичную воду с пластиковой пипеткой. Как только агароза полностью затвердеет, накройте агарозу слоем яичной воды.
После установки экологической камеры поместите 35-миллиметровую стеклянную нижнюю тарелку с зеброй в экологическую камеру. Откройте 405 диод, аргон мощностью 20% и лазер DPSS 561 нанометров. Настройка соответствующей лазерной мощности в настройках спектра.
Выберите последовательный режим приобретения сканирования XY и установите формат изображений до 512 на 512 пикселей. Переключитесь в режим живых данных, нацелитесь на положение первой зебры и отметь начало и конец позиции. Повторите этот процесс для каждого из оставшихся эмбрионов.
Добавьте паузу в конце программы. Определите цикл и цикл программы и сохраните файл. В этом исследовании мы использовали ранее сообщенные трансгенные coro1a:eGFP;lyzDsRed2 и трансгенные mpeg1loxP;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFP, чтобы различать макрофаги и нейтрофии in vivo.
Макрофаг, сильно закованные бактериями, стал круглым и показал снижение подвижности, с возможным цитоплазмическим отеком, разрывом клеточной мембраны и быстрым распространением цитоплазмического содержания. УФ-облученые макрофаги показали типичные фенотипы апоптотических клеток, такие как усадка клеток, ядерная фрагментация и конденсат хроматина. Также наблюдались макрофаги, активно фагоцитосные и распространяемые M.merinum.
Тем не менее, нейтрофилов имели ограниченные фагоцитные способности, и быстро подверглись смерти литических клеток без очевидного бактериального engorgement. В сочетании с мощными инструментами редактирования генов, этот протокол может обеспечить эффективную платформу для дальнейшего понимания влияния различных факторов на взаимодействие хозяина и патогена in vivo.
