Описанный здесь протокол позволяет исследовать функцию хемокина и поведение макрофагов in vivo. Большинство существующих экспериментальных моделей клеточного хемотаксиса основаны на экспериментах с клетками in vitro. Но эксперименты in vitro иногда слишком просты, чтобы моделировать сложную среду in vivo.
Кроме того, они не могут представлять способность к химиотерапии in vivo. Эти методы используют специфические преимущества рыбы зебры для прямого наблюдения за поведением клеток, что трудно для мышей. Начните с генерации трансгенных конструкций TGFABP-10A interleukin-34.
Введать FABP-10A интерлеукин-34 конструкций в одной клеточной стадии Tg (mpeg1:GFP)трансгенных и дикого типа эмбрионов рыб вместе с транспозазы MRNA. Поднимите и соберите эмбрионы в соответствии с рукописными инструкциями. Затем, исправить их с 4%paraformaldehyde ночь при температуре 4 градусов по Цельсию или в течение двух часов при комнатной температуре.
После фиксации, мыть эмбрионы с PBST три раза в течение пяти минут за стирку. Обезвоживать эмбрионы отдельно с 50%метанол в PBST, а затем 100% метанол, затем переоставить на свежий 100% метанол, и хранить их при отрицательном 20 градусов по Цельсию, по крайней мере 2 часа. Когда вы будете готовы к гибридизации зонда, регидратировать эмбрионы отдельно в 50% метанола в PBST.
Затем мыть их с PBST три раза в течение пяти минут за стирку. Переваривать эмбрионы с протеиназой K в PBST при комнатной температуре. Затем откажитесь от раствора пищеварения и повторите фиксацию с помощью 4%paraformaldehyde в течение 20 минут при комнатной температуре.
После фиксации, мыть эмбрионы дважды с PBST в течение 10 минут за стирку. Выполните предгибридизацию с подогревом буфера гибридизации при 65 градусах по Цельсию в течение по крайней мере одного часа. Затем разогреть межлеукин-34 зонд до 65 градусов по Цельсию в течение 10 минут.
Утилизация буфера гибридизации в оригинальную трубку и выполнить гибридизацию с разогретым зондом при 65 градусах по Цельсию в одночасье. На следующий день, мыть эмбрионы с 50%формамид и 2X SSCT следуют 2X SSCT, а затем 0.2X SSCT при 65 градусах по Цельсию. Повторите каждую стирку три раза с 20 минутами за стирку.
Затем, мыть эмбрионы три раза с PBST в течение пяти минут за стирку. Блокируйте образцы 600 миллилитров блокирующего буфера в течение одного часа при комнатной температуре. Затем добавьте 400 микролитров раствора антител против дигоксигенина HRP и инкубировать эмбрионы при четырех градусах Цельсия за одну ночь.
На следующий день, удалить антитела и мыть эмбрионы шесть раз с PBST в течение 20 минут за стирку. После последней стирки, промыть каждый образец с 30 микролитров 1X плюс разминования усиления в течение пяти минут. Инкубировать образцы фторфора тирамин рабочий раствор в течение пяти-15 минут в темноте.
Продление инкубации до 30 минут, если сигналы слабы. Затем мыть эмбрионы с PBST три раза в течение 10 минут за стирку. И инкубировать их с первичным антителом при четырех градусах по Цельсию в одночасье.
На следующий день, мыть эмбрионы пять раз с PBST в течение 30 минут за стирку, и инкубировать их вторичными антителами при четырех градусах по Цельсию в одночасье. На следующий день, мыть эмбрионы три раза в PBST в течение 10 минут за стирку, и хранить их в 70%глицерол в темноте при четырех градусах по Цельсию или отрицательные 20 градусов по Цельсию дольше. Перед визуализацией используйте флуоресцентный микроскоп для выбора красных и GFP двойных положительных эмбрионов DS.
Чтобы смонтировать рыбу, используйте металлическую ванну, чтобы нагреть один миллилитр 1%низкий плавления агарозы выше 90 градусов по Цельсию. Затем охладить его до температуры тела и смешать в 50 микролитров 0,2% tricaine. Перенесите обезболеженные эмбрионы в небольшое блюдо, установленное с крышкой слайда на дне.
Удалите окружающую воду и медленно уронить низкоплавильную агарозу на эмбрионы. Тщательно установите положение рыбы, прежде чем агароза затвердеет, сохраняя область печени близко к крышке слайда. После того, как агароза затвердевет, тщательно накройте ее другим слоем агарозы, чтобы укрепить его.
Поместите блюдо на стол носителя конфокального микроскопа, накройте рыбу раствором Е2 с помощью tricaine и начните визуализацию. Для работы конфокального микроскопа откройте программное обеспечение Дзен Блэк 2.3 и нажмите кнопку найти, затем инкубации, а затем установить температуру до 29 градусов по Цельсию. Нажмите на меню приобретения и выберите необходимый режим сканирования и лазеры в меню смарт-настройки.
Затем выберите стек и позицию. Нажмите на экспериментальное меню дизайнера и выберите включить многоблоковой эксперимент в первом блоке, чтобы найти образец под низким увеличением. Затем переключитесь на высокое увеличение и позвольте наблюдаемой области в центре поля зрения.
Установите информацию о положении и стеке. Затем выберите соответствующую интенсивность лазера, слои сканирования и скорость изображения. После установки всех блоков установите соответствующее количество циклов и начните запись.
Этот протокол был использован для введения печени конкретных интерлейкин-34 над выражением плазмид в трансгенных эмбрионов рыб, которые макрофаги были помечены GFP. Полная флуоресценция на месте гибридизации и иммуностимулирования были использованы для анализа экспрессии интерлейкина-34 и GFP помечены макрофаги. Номера клеток макрофагов были количественно проанализированы в необъективной и конструкции инъекционных эмбрионов печени и хвостовой области.
Для непосредственного наблюдения за макрофагами, помеченными зелеными, проходящей мимо печени контрольной рыбы и мигрирующей в печень интерлейкина-34 над экспрессией рыбы, использовалась живая визуализация. Важные шаги этого протокола включают выбор подходящей трансгенной линии для обозначения ячейки интересов. И соответствующие ткани для визуализации вашего выражения трансгенного гена, а также соответствующее окно времени наблюдения.
Этот метод может быть применен для изучения функции других хемокинов на поведение других клеток, таких как Т-клетки и нейтрофилов in vivo.
