3D многоцветная ДНК FISH позволяет визуализировать множественные геномные локусы внутри сохранившихся ядер, чтобы неоднозначно определить их взаимное взаимодействие и локализацию на уровне одной клетки. 3D многоцветная ДНК FISH позволяет непосредственно изучат ядерную архитектуру. Как правило, он работает в сочетании с технологиями захвата хромосом, что делает метод доступным инструментом для проверки данных C в пределах отдельных клеток.
Демонстрацией процедуры будет Федерика Мараска. Она постдок в моей лаборатории. Начните с инкубации смеси ник перевода в тепловой смеситель при 16 градусов по Цельсию в зависимости от длины исходного материала ДНК.
В конце инкубации проверьте размер зондов на 2,2%агарозного геля. Для каждого эксперимента DNA FISH, осадок соответствующее количество зонда в соответствии со стартовым материалом ДНК, из которого зонды были произведены в 150 микролитров двойной дистиллированной воды, 20 микрограммов неолицеприятных ДНК спермы лосося, 3,5 микрограмма видов конкретных Cot-1 ДНК, три тома 100% этанола, и 1/10 объем трех молира ацета натрия в течение одного часа при температуре минус 80 градусов по Цельсию. В конце инкубации центрифуга образца на максимальной скорости в течение одного часа при четырех градусах по Цельсию.
После отказа от супернатанта, мыть гранулы два раза с 500 микролитров 70% этанола. После второй стирки, повторно гранулы в двух микролитров 100%formamide и встряхнуть зонд в течение 30 минут при 40 градусах по Цельсию, прежде чем добавить равный объем 4X солевого соляного цитрата в 20%dextran сульфат. Для фиксации предварительной обработки и пермеабилизации мелких клеток с небольшими ядрами и небольшим количеством цитоплазмы, сначала добавьте два раза 10 к шестым клеткам в 200 микролитров PBS непосредственно на стеклянные крышки в отдельных колодцах 24-хорошо пластины и позволяют клеткам осесть в течение 30 минут при комнатной температуре.
В конце инкубации, быстро заменить PBS с 300 микролитров свежеприготовленных 4%paraformaldehyde дополнен 0,1%Tween 20. Через 10 минут мыть фиксированные клетки три раза в 300 микролитров 0,05%TPBS в течение пяти минут на стирку при комнатной температуре. После последней стирки, permeabilize Т-клеток с 300 микролитров 0,5%TPBS в течение 10 минут при комнатной температуре перед лечением клеток с 250 микролитров на колодец RNAse коктейль разбавленной 1:100 в PBS в течение одного часа при температуре 37 градусов по Цельсию.
В конце инкубации, промыть клетки в 300 микролитров PBS и добавить 300 микролитров 20%глицерол в PBS к каждому хорошо с ночной инкубации при четырех градусах по Цельсию. На следующее утро поместите стекло на сухой лед на 15-30 секунд, чтобы заморозить клетки, прежде чем постепенно оттаивать образцы при комнатной температуре и замачивать их в 300 микролитров 20%глицерол в PBS в течение 30 секунд. После замораживания/ оттаивания клеток еще в три раза, как только что продемонстрировано, мыть образцы в 300 микролитров 0,5%TPBS в течение пяти минут при комнатной температуре, а затем две моет в 300 микролитров 0,05%TPBS в течение пяти минут на стирку при комнатной температуре.
После последней стирки обработать клетки 300 микролитров 0,1 нормальной соляной кислоты в течение 12 минут при комнатной температуре, а затем два полоскания в 300 микролитров солевого цитрата натрия. Затем исправить образцы на ночь в 300 микролитров 50%формамида в 2X солевой цитрат натрия при комнатной температуре. Для фиксации, предварительного лечения и проницаемки больших клеток с большим количеством цитоплазмы, исправить, предварительно лечить и проницать клетки так же, как попродемонстрировано для человека первичных Т-клеток и лечения образцов с 300 микролитров 0,0025%пепсин в 0,01 нормальной соляной кислоты в течение нескольких секунд до пяти минут.
Наблюдайте за клетками под оптическим микроскопом и остановите реакцию двумя пятиминутными мойки в 300 микролитров 50 миллимолярный хлорид магния, как только ядра свободны от цитоплазмы, но нуклеолы все еще видны и нетронутыми. Для 3D многоцветной ДНК FISH, денатурации гибридизации зондов при 80 градусов по Цельсию в течение пяти минут и сразу же разместить зонды на льду. Загрузите зонды на чистый слайд микроскопа и поместите одну крышку клеток на каждую каплю зонда.
Печать края крышки с резиновым цементом. Когда цемент полностью высохнет, денатурировать образцы на 75 градусов по Цельсию нагревательного блока. Через четыре минуты, гидрогидридизировать образцы при 37 градусов по Цельсию ночь в металлической коробке плавающей в водяной бане.
На следующее утро, снять резиновый цемент и со слайдами погружается в 2X солевой цитрат натрия тщательно снять крышки. Поместите каждый coverslip в отдельных скважин из шести скважин пластины, содержащей два миллилитров свежего солевого цитрата натрия на скважину в течение двух пяти минут моет при 37 градусов по Цельсию с встряхивания на 90 оборотов в минуту. В конце инкубации, промыть coverslips кратко в двух миллилитров 0,2%Tween 20 в 4X солевой цитрат натрия.
Для обнаружения 3D-многоцветной ДНК FISH перенесите крышки в отдельные скважины новой пластины из 24 скважин и блокируйте любые неспецифические привязки в 300 микролитров блокирующего буфера в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия и 20 революциях в минуту. В конце инкубации обработать образцы с соответствующей концентрацией анти-дигоксигенина и/или стрептавидина, разбавленного блокирующим буфером в течение 35 минут в темной и влажной камере при 37 градусах Цельсия. В конце инкубации перенесите образцы в отдельные скважины из шести скважин пластины и мыть образцы три раза в двух миллилитров 0,2%Tween 20 и 4X солевой цитрат натрия в течение пяти минут за стирку с тряской на 90 оборотов в минуту.
После последней стирки, equilibrate образцов в двух миллилитров PBS перед передачей coverslips на новый 24-хорошо пластины для пост-фиксации в 300 микролитров 2%формальдегида в PBS в хорошо в течение двух минут при комнатной температуре. Вымойте фиксированные клетки пять раз кратко в 300 микролитров PBS, а затем окрашивание с DAPI разбавленной на один нанограмм на миллилитр в 300 микролитров PBS в течение пяти минут при комнатной температуре. Вымойте крышки еще пять раз в PBS и смонтировать образцы с соответствующей крепления среды.
Затем приобретайте 3D-изображения с помощью микроскопной системы. 3D многоцветная ДНК FISH позволяет современную визуализацию различных геномных локусов в сохранившихся 3D ядрах. Для подготовки ДНК-зонда размер зонда менее 200 базовых пар обеспечивает успешную 3D многоцветную процедуру FISH ДНК.
Неоптимальные зонды ДНК FISH, производимые переводом ника, могут быть частично или переварены. Переваренные зонды приведут к неспецифическому сигналу из-за потери специфичности в гибридизации и последующего увеличения фона. Для человека первичных Т-лимфоцитов и небольших клеток с небольшими ядрами и небольшим количеством цитоплазмы, 12-минутный 0,1 нормального лечения соляной кислоты рекомендуется содействовать нуклей доступности ДНК зондов и сохранить ядерную целостность.
Цитоплазмическое пищеварение пепсин не требуется для получения ДНК FISH хороший сигнал в небольших клетках. Для человека первичных миобластов и клеток, которые имеют большие ядра и обильные цитоплазмы, однако, шаг пепсинизации имеет основополагающее значение. Короткая и неоптимальная цитоскелетная пепсинизация будет препятствовать проникновению зонда в ядра, заканчивающийся при отсутствии сигнала ДНК FISH.
Однако, если клетки чрезмерно пепсинизированы, ядра не останутся нетронутыми, теряя свою 3D структуру. Успешная 3D многоцветная ДНК FISH приведет к присутствию сигнала внутри ядер. Предлагаю работать со свежим биологическим материалом, тестировать зонды перед выполнением 3D многоцветной ДНК FISH, готовить свежие растворы и быть точным со временем инкубации и температурой.
Помните, что формамид и HCL являются опасными веществами и всегда должны использоваться в химическом дымовом капоте с соответствующими одноразовыми материалами.
