Эта работа была поддержана грантом Национальных институтов здравоохранения 1R21AI094289 Игорю В. Шарахову

Авторов нечего раскрывать.

Есть несколько шагов, критически важных для успешного усиления ДНК из микродиссектных образцов политеной хромосомы. Протокол использует LCM, метод, который как повышает общую эффективность и снижает воздействие чужой ДНК путем удаления взаимодействия физических инструментов с образцом. Тем не менее, усиление чужой ДНК по-прежнему является самой большой потенциальной ловушкой этого эксперимента. Таким образом, в течение всего процесса необходимо держать образцы защищенными от загрязнения. На протяжении всего слайд подготовки и микродиссекции фазы, важно, чтобы этанол мыть вскрытия иглы, слайды, крышка скользит, а также рабочее пространство.  Также рекомендуется уфимец обработать все применимое оборудование (иглы, горки, крышки) перед использованием.
Мембрана на слайдах вскрытия делает распространение хромосом очень трудным.  Важно использовать больше яичников (половина до полной пары яичников) при принятии этих слайдов, чтобы обеспечить больше шансов найти хорошо распространения ядра.  Также рекомендуется использовать свежие ткани при создании слайдов, так как показатели усиления, как представляется, падают, как ткани возрасте 49 лет и хромосомы распространения становится все более сложной задачей.  Подготовка слайдов для микропересмешки является наиболее трудоемким шагом в этом протоколе.  Хромосомы должны быть хорошо распространены, чтобы избежать случайного приобретения нежелательного материала.  Окрашивание Giemsa позволяет пользователю проверить качество распространения с помощью фазового контрастного микроскопа перед использованием системы микропереписьа.
Сочетание микродиссеции и усиления дает возможность извлекать и анализировать хромосомные фрагменты размером от небольших областей, представляющих интерес для большинства вооружений.  Этот протокол позволяет пользователю получить ДНК из морфологически различных регионов, таких как инверсии, специфические эвхроматические полосы и интербанды, теломерные, центрометрические и межкалорийные хетерохроматин. Пользователь может применить генерируемые зонды живописи к изучению аномальных хромосом, изучению меж видам гомологии в определенных локусах или характеристике пространственной организации хромосом в нетронутом 3D ядре. Для разработки хромосомных красок мы выбрали эухроматические сегменты, чтобы избежать гибридизации повторяющейся ДНК с несколькими хромосомными областями. В результате мы получили картину, специфичную для рук, без использования конкурента, например, геномнуюДНК или фракцию ДНКC 0 t-1.
Мы решили использовать GenomePlex WGA и REPLI-G комплекты на основе обзоров, которые сравнили эффективность и уровень отсева нескольких комплектов усиления 40,44.  Оба комплекта показали лучшие результаты среди доступных методов в обоих отсева (GenomePlex был 12,5% ставка по сравнению с REPLI-G в 37,5%) и процент усиленных маркеров (GenomePlex имел 45,24% уровень усиления против 30,0%) 40.Комплект GenomePlex также предоставил большее количество ДНК, и, таким образом, сделал его лучшим кандидатом для нескольких методов вниз по течению.  Также имеется комплект для повторного усиления системы GenomePlex, позволяющий еще больше подколоть ДНК. Однако важно отметить, что усиление не является совершенным.  Остается возможность того, что успешное усиление может привести к ошибкам или иметь уклон в сторону конкретных локусов в целевой ДНК. Важно рассмотреть окончательный размер фрагмента имеющихся методов усиления генома.  Фрагментация GenomePlex приводит к библиотеке с фрагментами от 200-500 bp, в то время как комплект REPLI-g производит фрагменты размером примерно 10-20 кб. Предполагаемое применение этого протокола ниже по течению является FISH, что делает комплект GenomePlex более осуществимым вариантом, поскольку он обеспечивает желаемый размер фрагмента и возможность маркировать фрагменты ДНК непосредственно через WGA. Длинные молекулы ДНК, производимые усилением REPLI-g, должны быть фрагментированы в реакции маркировки ник-перевода ниже по течению.
Этот протокол был адаптирован для успешного усиления ДНК из одной руки политеной хромосомы.  Другие протоколы требуют объединения многих (обычно 10-30) фрагментов хромосом для того, чтобы успешно усилить образец 7,11,28,40.  Хотя объединение нескольких хромосом возможно с помощью нашего метода, повышенная вероятность загрязнения образца подчеркивает важность начала эксперимента с как можно меньше хромосом. Если политен хромосомы не доступны, наш протокол может быть адаптирован для использования в митотических хромосомах. Это может быть необходимо, однако, объединить 10-15 митотических хромосом до усиления для успешного FISH 11. Смещение усиления ниже с большим количеством исходного шаблона DNA 50. Политеновые хромосомы обеспечивают приблизительно 512 копий одной последовательности ДНК и 1024 копии двух гомологичные последовательности ДНК.  Таким образом, объединение митотических хромосом поможет повысить общее качество продукта ДНК после усиления.
Эта процедура имеет много потенциальных применений в цитогенетических и геномных исследованиях. Здесь мы использовали хромосомные краски для установления соответствия между эухроматических сегментов политен и митотической хромосомы оружия в An. gambiae. Те же зонды живописи могут быть применены к цитогенетическим характеристикам линий клеток An. gambiae. Обширные геномные перестановки и изменения в числах хромосом являются общими особенностями клеточных линий 51,52. Анеуплоидия, полиплоидия и хромосомные перестановки, такие как транслокации, инверсии, удаления и кольцевые хромосомы были обнаружены в различных линиях клеток комаров 53,54. Классические цитогенетические наблюдения 55 и физическое картирование 56 продемонстрировали возникновение хромосомных транслокаций в эволюции малярийных комаров. Таким образом, микродиссектный материал может быть использован в сочетании с экспериментами FISH для сравнения гомологии хромосомных областей между видами. Мы успешно выполнили 3D FISH с 2R-картинным зондом на политеновых хромосомах в клетках медсестры в целом. Этот метод облегчит отслеживание хромосомных траекторий и изучение ядерной архитектуры в Anopheles. Такие методы, как генотипирование ДНК 57,58, секвенирование генома следующего поколения 26,27, физическое и соединение карты развития, и генерации зондов для хромосомной живописи 33,59 все могут извлечь выгоду из руки и региона конкретных микродиссекции. Объединив технологию LCM и продвигая одноклеточную WGA, мы демонстрируем эффективный, практичный метод производства разумного количества ДНК из одной политеной хромосомы руки.

Хромосомная живопись является полезным методом для изучения эволюции кариотипов 1-5 и для визуализации цитогенетических аномалий с помощью гибридизации флуоресцентно помечены хромосомной ДНК 1,6-8. Этот метод также применяется к изучению 3D-динамики хромосомных территорий в развитии 9 и патологии 10. Дифференциально помеченные хромосомные краски используются для визуализации отдельных митотических 11,12, мейотических 13,14или межфазных нелифазных не политен 15,16 и политен 9,11,17 хромосом. Простой и надежный протокол для получения хромосомных красок был бы очень полезен в распространении этого метода на не моделевые организмы, такие как комары. Комплекс Anopheles gambiae – это группа из семи морфологически неразличимых комаров, которые различаются по поведению и адаптации, включая способность передавать малярию.  Эти комары служат отличной моделью, чтобы лучше понять эволюцию тесно связанных видов, которые сильно отличаются по своей векторной способности.  Большинство цитогенетических исследований малярийных комаров были проведены с использованием хорошо развитых, высоко политенизированных хромосом (рассмотрено в 18,19). Читаемые модели полос поликретных хромосом позволили исследователям продемонстрировать связь между полиморфными инверсиями и экологической адаптацией в Anopheles gambiae 20. Кроме того, в комплексе An. macullipennis были охарактеризованы специфические для тканей 21 и видоспецифические 22 особенности 3D-политеной хромосомы. Тем не менее, изучение митотических хромосом может предоставить дополнительную важную информацию. Например, более высокий уровень полиморфизма гетерохроматина, наблюдаемый в митотических хромосомах, коррелирует со снижением брачной активности и фертильности в An. gambiae 23. Переписку между эвхроматическими сегментами политеных и митотических хромосомных рук трудно установить только путем сравнения их относительной длины. Это потому, что хетерохроматин составляет значительную часть митотических хромосом, но недопредставлен в политенные хромосомы 24. Наличие хромосомных красок для малярийных комаров позволит исследователям значительно расширить цитогенетические исследования, включив в нее дополнительные виды, при этом существенно сократив затраты и время при анализе кариотипической эволюции и 3D-динамики хромосом в этой группе эпидемиологиологически важных насекомых.
Для того, чтобы получить большие участки хромосом, микроперемида стала неотъемлемой техникой для манипулирования и изоляции конкретных областей, представляющих интерес для хромосомного дополнения.  В сочетании с усилением всего генома (WGA), микроперемида приводит к мощным приложениям вниз потечению,включая FISH 11,12 и секвенирование генома следующего поколения 25-27. Ранее методика требовала использования специализированных микропересмешования игл, которыми должен был управлять опытный пользователь 28.  Развитие микродиссеции лазерного захвата (LCM) привело к упрощенному инструменту, лучше подходящему для изоляции одиночных клеток 29,30 или отдельных хромосом 31-33 с уменьшенным риском заражения. Такой подход позволяет пользователю изучать генетические неоднородности и хромосомные аномалии, которые происходят в одиночных клетках, вместо консенсусного ландшафта, который является результатом объединения нескольких клеток вместе 34-36. Для усиления ДНК, образоваемой в результате микропересовок, было использовано несколько методов.  DOP-PCR, метод, полезный для усиления высоко повторяющихся последовательностей, был использован для усиления микродиссекции хромосом от видов, включая кузнечика 37, колючий угорь 38, и Нил тилапии 39.  Совсем недавно, PCR основе GenomePlex WGA4 одноклеточный комплект и несколько усиления смещения на основе (MDA) Repli-G одноклеточный комплект стали ценными инструментами для экспериментов, связанных с генетическим анализом одиночныхклеток человека, а также хромосомы 40-42, в том числе B хромосомных систем в кузнечиков 37 и саранчи 43. Эти два комплекта имеют преимущества и недостатки, но их явное превосходство над другими доступными системами усиления было продемонстрировано 44.
Количество ДНК, которое может быть получено из одной хромосомы или хромосомного сегмента, значительно меньше, чем у целого ядра. Поэтому микроперемиск, усиление и последующий анализ одной хромосомы являются гораздо более сложными, особенно в организмах с небольшими геномами, как в Drosophila или Anopheles.  Хотя краски были разработаны из одного микродиссектных хромосом человека 33 и оса 45, успешный эксперимент FISH требует нескольких (по крайней мере 10-15) микродиссектных митотических хромосом плодовой мухи 11. Тем не менее, способность к микродизайзацию и усиление одной хромосомы будет иметь важное значение для i) снижение вероятность загрязнения материалом из другой хромосомы, (ii) минимизации числа хромосомных препаратов, необходимых для микродиссции, (iii) снижение нуклеотида и структурного полиморфизма микродиссекции образца как в FISH, так и в секвенировании вниз по течению. Политене хромосомы, найденные во многих видах диптериан предлагают уникальную возможность приобрести гораздо более высокое исходное количество ДНК. Они также обеспечивают более высокое разрешение и хромосомную структуру, которые не могут быть достигнуты с помощью митотических хромосом. Это добавленное разрешение может иметь решающее значение для визуализации хромосомных перестановок, хроматиновой структуры и хромосомных сегментов, которые будут микродиссектированы 28,46.
Здесь мы представляем процедуру эффективной изоляции эухроматический сегмент от одной политеной хромосомы руки, усилить ДНК, и использовать его в нижнем течении FISH приложений у малярийных комаров.  Во-первых, мы применяем LCM, чтобы изолировать и извлечь одну хромосомную руку из специально подготовленных мембранных слайдов. Во-вторых, WGA используется для усиления ДНК из микродиссектного материала. В-третьих, мы гибридизируем усиленную ДНК в экспериментах FISH для препаратов из политеного сквоша 47,метафазы и межфазной хромосомы слайдов 48,а также 3D образцов яичников. Эта процедура была сделана, чтобы успешно нарисовать большинство евхроматина в хромосомных руках An. gambiae.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A491-212</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Methanol</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:120px;">A412-4</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Propionic acid&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">402907</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Membrane slides 1.0 PET</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9051-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Buffer tablets &#8220;GURR&#8221;</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10582-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">KaryoMAX Giemsa Stain</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10092-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System</td>
			<td style="width:112px;">Abbott Molecular</td>
			<td style="width:120px;">30-144110</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Vacufuge vacuum concentrator</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22820001</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">11-992-89</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:191px;">Thermo Scientific NanoDrop</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">ND-2000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">REPLI-g Single Cell Kit</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">150343</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:191px;">GenomePlex Single Cell Kit (WGA4)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA4-10RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA3-50RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">MZ6 Leica stereomicroscope</td>
			<td style="width:112px;">Leica</td>
			<td style="width:120px;">VA-OM-E194-354</td>
			<td style="width:139px;">A different stereomicroscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Olympus CX41 Phase Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Olympus</td>
			<td style="width:120px;">CX41RF-5</td>
			<td style="width:139px;">A different phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Thermomixer</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22670000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">10x PBS</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P5493</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">50x Denhardt&#8217;s solution</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D2532</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">99% Formamide</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP227500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Dextran sulfate sodium salt</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">D8906</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">20x SSC buffer</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">AM9765</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P-36931</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">R0141, R0151, R0161, R0171</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:120px;">PA53022, PA55022</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">BSA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3294</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNA polymerase I</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EP0041</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EN0521</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S3256-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermidine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S0266-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP366-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP3581</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EGTA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">E0396-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">PIPES</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P6757-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EDTA</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">S311-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Digitonin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D141-100MG</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP151-100</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">AdhesiveCap 500 clear</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9211-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">QIAamp DNA Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">56304</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Genomic DNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td style="width:112px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:120px;">D4010</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">37% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">F79-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes

Флуоресцентная гибридизация на месте (FISH) зондов хромосомы целых рук является надежным методом для картирования геномных областей, представляющих интерес, обнаружения хромосомных перестановок и изучения трехмерной (3D) организации хромосом в ядре клетки. Появление микродиссеции захвата лазера (LCM) и усиления всего генома (WGA) позволяет получать большое количество ДНК из одиночных клеток. Повышенная чувствительность комплектов WGA побудила нас разработать хромосомные краски и использовать их для изучения организации хромосом и эволюции в не моделных организмах. Здесь мы представляем простой метод для изоляции и усиления эухроматических сегментов одной политенской хромосомы оружия из яичников клетки медсестры африканского малярийного комара Anopheles gambiae. Эта процедура обеспечивает эффективную платформу для получения хромосомных красок, уменьшая при этом общий риск введения в образец иномаенной ДНК. Использование WGA позволяет несколько раундов повторного усиления, в результате чего большое количество ДНК, которые могут быть использованы для нескольких экспериментов, в том числе 2D и 3D FISH. Мы показали, что разработанные хромосомные краски могут быть успешно использованы для установления соответствия между эвхроматических частей политен и митотической хромосомы оружия в An. gambiae. В целом, объединение LCM и однофомохм WGA обеспечивает эффективный инструмент для создания значительного количества целевой ДНК для будущих цитогенетических и геномных исследований.

На рисунке 1 описывается общий поток протоколов, описанных в данной статье.  Пользователь изначально начинает с микродисразделения образцов хромосомной ДНК с мембранных слайдов.  Микродиссектный материал извлекается и очищается. Очищенная ДНК затем усиливается, усиливается, маркируется, а затем используется для FISH для обозначения хромосомных спредов.
Протокол LCM может быть разбит на три общих шага: 1) Поиск хромосом, представляющих интерес, и подготовка региона к резке(рисунок 2A), 2) Резка и катапультирование хромосомы области интереса с помощью лазера (Рисунок 2B), и 3) Проверка, чтобы определить, если образец на самом деле катапультировался в клей крышку (Рисунок 2C). Процесс LCM, используемый на an. gambiae Sua штамма политен хромосомы показано в видео 1. Видео подробно весь процесс от запуска программы, в том числе важные функции программного обеспечения и советы.
Комплекты GenomePlex и REPLI-g, используемые в этом протоколе, сильно отличаются размером продукта, а также общей урожайностью.  На рисунке 3 показаны результаты гелеобразования, продихаемого для комплектов GenomePlex и REPLI-g, а также количественная оценка образцов Nanodrop.
Микродиссектный материал был использован для создания зондов FISH, которые нацелены на эвхроматические области хромосомы.  На рисунке 4 демонстрируется FISH пяти зондов, генерируемых из микродиссектированного материала на политенных хромосомах An. gambiae.  Четыре аутосомные руки были помечены тремя флюорофорами с использованием комплекта WGA3: 3R-хромосома помечена зеленым цветом (флуорессейн), 3L-хромосома находится в смеси красного (Cy-3) и желтого цвета (Cy-5), 2R-хромосома в желтом цвете (Cy-5), а хромосома 2L в красном цвете (Cy-3). Х-хромосома была помечена оранжевым цветом (Cy-3) с использованием ник-перевода материала REPLI-g в отдельном эксперименте. Для установления соответствия между эвхроматических частей политен и митотических хромосомных рук, хромосомные краски были гибридизированы для интерфазы, профазы, прометафазы и метафазных хромосом An. gambiae (рисунок 5).  Для визуализации 3D-организации одной политеной хромосомы руки в ядре клетки, вся гора FISH была выполнена на An. gambiae Sua штамма яичников клетки медсестры (Видео 2).  Различные хромосомные территории руки хорошо видны в ядрах с интерфазом(рисунок 5D)и политеной (видео 2) хромосомами.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1.jpg"> Рисунок 1. Схематическое представление экспериментальных процедур по подготовке хромосомных красок. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2.jpg"> Рисунок 2. Основные шаги в хромосомной микропересмешивании. A) Лазерная резка хромосомной области, представляющих интерес через мембрану. B) Мембрана с отверстием после катапультирования выполняется. C) Вид катапультированной части мембраны с хромосомным сегментом в ней, прикрепленный к клейкой крышке. Стрелка указывает на хетерохроматин Х-хромосомы, который остался на слайде. Звездочка показывает кусок другой хромосомы, которая осталась на слайде. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3.jpg"> Рисунок 3. Агароза гель изображения, показывающие ДНК после WGA. A) Низкий молекулярный вес (200-500 bp) ДНК от руки 3R после использования комплектов WGA4 и WGA3 GenomePlex. B) Высокий молекулярный вес (10-20 кб) ДНК из руки 2L после усиления REPLI-g. Лестница 100 bp показана в левой полосе движения. Таблицы ниже гель изображения показывают концентрации ДНК измеряется Nanodrop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4.jpg"> Рисунок 4. Картина политеных хромосом из клеток медсестры яичников An. gambiae с использованием четырех зондов, генерируемых из микродиссектированного материала. Х-хромосома помечена оранжевым цветом (Cy-3) ник-переводом материала REPLI-g. Рука 2R помечена желтым цветом (Cy-5); 2L рука в красном (Cy-3); 3R рука помечена зеленым цветом (фторсейн); 3L рука помечена в смеси красного (Cy-3) и желтого (Cy-5). Автосомы помечены комплектом усиления WGA3. Хроматин окрашен в синий цвет (DAPI). Названия хромосом расположены вблизи теломерных областей. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5.jpg"> Рисунок 5. Картина межфазы (A), профазы (B), прометафазы (C) и метафазы (D) хромосом из личиночных воображаемых дисков штамма An. gambiae Mopti с использованием трех зондов, генерируемых из микродиссектированного материала, помеченного WGA3. Рука 2R помечена зеленым цветом (флуорессейн); рука 2L не помечена; 3R рука в розовом, смесь красного (Cy-3) и оранжевый (Cy-5); рука 3L помечена оранжевым цветом (Cy-5). Х-хромосома имеет красную метку, соответствующую зонду 18S rDNA. Хроматин окрашен в синий цвет (DAPI). Ярко окрашенные области хромосом соответствуют хетерохроматину. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.</a>
Видео 1. Процесс LCM хромосом An. gambiae polytene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Sharakhov_video1.mp4" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть видео 1.</a>
Видео 2. Целый крепление 3D FISH выполняется на An. gambiae клетки медсестры яичников. Зонд помечен в Cy-3 (изображен синим цветом) и сделан из микродиссектной руки 2R-хромосомы.  Хроматин был окрашен в DAPI и изображен голубой псевдоцветной (светло-голубой). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Video2.avi" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть видео 2.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes at JoVE.com

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Хромосомная живопись является полезным методом для изучения организации ядра клетки и эволюции кариотипа. Здесь мы демонстрируем подход к изоляции и усилению определенных областей интереса от одиночных политеных хромосом, которые впоследствии используются для двух- и трехмерной флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).

2D и 3D хромосомная живопись у малярийных комаров

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

2d-and-3d-chromosome-painting-in-malaria-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K Views.  Virginia Tech. Хромосомная живопись является полезным методом для изучения организации ядра клетки и эволюции кариотипа. Здесь мы демонстрируем подход к изоляции и усилению определенных областей интереса от одиночных политеных хромосом, которые впоследствии используютс...

Video: 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

Простой протокол Chelex для выделения ДНК из<em&gt; Anopheles</em&gt; SPP.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

Гибридизация<em&gt; На месте</em&gt; Слюнных желез, яичников, а также эмбрионы комаров

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Флуоресцентный<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизации на митотических хромосом от комаров

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

Быстрое Анализ хромосомных аберраций в Mouse-лимфоцитов на PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been accompanied by increased genomic information about Plasmodium parasite species responsible for malaria, including characteristics of geographical populations as well as variations associated with reduced susceptibility to anti-malarial drugs.
One common genetic variation, single-nucleotide polymorphisms (SNPs), offers attractive targets for parasite genotyping. These markers are useful not only for tracking drug resistance markers but also for tracking parasite populations using markers not under drug or other selective pressures.
SNP genotyping methods offer the ability to track drug resistance as well as to fingerprint individual parasites for population surveillance, particularly in response to malaria control efforts in regions nearing elimination status.
While informative SNPs have been identified that are agnostic to specific genotyping technologies, high-resolution melting (HRM) analysis is particularly suited to field-based studies. Compared to standard fluorescent-probe based methods that require individual SNPs in a single labeled probe and offer at best 10% sensitivity to detect SNPs in samples that contain multiple genomes (polygenomic), HRM offers 2-5% sensitivity. Modifications to HRM, such as blocked probes and asymmetric primer concentrations as well as optimization of amplification annealing temperatures to bias PCR towards amplification of the minor allele, further increase the sensitivity of HRM. While the sensitivity improvement depends on the specific assay, we have increased detection sensitivities to less than 1% of the minor allele.
In regions approaching malaria eradication, early detection of emerging or imported drug resistance is essential for prompt response. Similarly, the ability to detect polygenomic infections and differentiate imported parasite types from cryptic local reservoirs can inform control programs.
This manuscript describes modifications to high resolution melting technology that further increase its sensitivity to identify polygenomic infections in patient samples.

While high resolution melting analysis offers the ability to differentiate between single nucleotide polymorphisms in a heterogeneous population, mutant allele amplification bias can increase its ability to detect alleles present at relatively low percentages within a sample. This protocol describes improvements that improve the sensitivity of high resolution melting analysis.

Методы повышения чувствительности с высоким разрешением Melting полиморфизм единичного нуклеотида генотипирования в малярией

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель для измерения иммунных ответов на малярией в контексте ВИЧ-инфекцией

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible for most malaria-related deaths globally. Several factors including parasite sequestration in tissues, vascular dysfunction, and inflammatory responses influence the evolution of the disease in malaria-infected people. P. falciparum-infected red blood cells (iRBCs) release small extracellular vesicles (EVs) containing different kinds of cargo molecules that mediate pathogenesis and cellular communication between parasites and host. EVs are efficiently taken up by cells in which they modulate their function. Here we discuss strategies to address the role of EVs in parasite-host interactions. First, we describe a straightforward method for labeling and tracking EV internalization by endothelial cells, using a green cell linker dye. Second, we report a simple way to measure permeability across an endothelial cell monolayer by using a fluorescently labeled dextran. Finally, we show how to investigate the role of small non-coding RNA molecules in endothelial cell function.

In this work, we describe protocols to investigate the role of extracellular vesicles (EVs) released by Plasmodium falciparum infected erythrocytes. In particular, we focus on the interactions of EVs with endothelial cells.

Оценка функции внеклеточного пузырьков во время инфекции малярии

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

Спасение рекомбинантного вируса Зика от бактериальной искусственной хромосомы клона

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Анализ компетентности переносчиков комаров Aedes aegypti с использованием вируса Зика

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Распространение микроспоридского паразита Edhazardia aedis у комаров Aedes aegypti

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...