LarvaSPA является первым методом, который позволяет непрерывно живую визуализацию нетронутых личинок дрозофила в течение более 10 часов с высоким временным и пространственным разрешением. Этот метод используется для выявления динамических клеточных процессов личинок периферических сенсорных нейронов и для изучения многих других клеточных процессов, которые происходят вблизи стенки тела личинки. Этот метод прост в использовании и имеет меньше ограничений по размеру личинки.
Шесть-девять личинок могут быть установлены в камере визуализации в то же время, что делает эксперимент возможным. Камера визуализации в кубоидах PDMS может быть изготовлена с минимальными затратами и многоразовая. Этот метод особенно полезен для изучения механизмов развития дендрита и дегенерации дендрита с использованием дронофилы личинок дендритных авторизации нейронов.
Возможность изображения одного и того же нейрона в течение нескольких часов может показать, как долгосрочные глобальные изменения дендритных моделей возникают в результате краткосрочного поведения на индивидуальном уровне ветви. Использование кубоидов PDMS, которые соответствуют размерам личинок, увеличит успешность иммобилизации личинок. Пожалуйста, найдите более полезные ленты в нашем разделе устранения неполадок.
Построив алюминиевый блок из машинного цеха, запечатайте дно металлической рамы с помощью длинного крышки с ультрафиолетовым клеем. Лечить УФ ключ с помощью портативного УФ-лампы в течение 30 секунд. Прикрепите слои упаковочной ленты к внутренней поверхности прямоугольной чашки Петри или круглой пластины культуры клеток.
Используйте один слой для второй личинки звезды, два слоя для ранних третьих личинок звезды, или три слоя для поздней трети в звезде личинок. Разрежьте ленту на поездки определенной ширины лезвием бритвы, 1,5 миллиметра для ленты одного слоя и два миллиметра для двухслойной или трехслойной ленты. Оставьте между двумя полосами не менее пятимиллиметрового пространства.
Удалите слои ленты, покрывающие пространство. Удалите пыль с внутренней поверхности пластины с помощью липкой ленты. После этого форма готова к использованию.
Для приготовления смеси PDMS, смешать семь граммов PDMS базы в 0,7 грамма лечебного средства тщательно в небольшой контейнер. Поместите контейнер в вакуумный децикатор, по крайней мере 15 минут, чтобы удалить воздух из смеси. Медленно налейте около 5,5 граммов смеси PDMS на форму, чтобы достичь толщиной от одного до двух миллиметров.
Поместите смесь PDMS в вакуумный децикатор снова, по крайней мере 15 минут, чтобы удалить оставшиеся пузырьки воздуха из смеси. Разбей последние несколько пузырей кончиком пипетки. Лечить PDMS на плоской поверхности в тепловом инкубаторе при температуре 65 градусов по Цельсию в течение двух часов.
Затем используйте лезвие бритвы, чтобы ослабить вылеченную PDMS вдоль края формы и отделить его от формы. Храните PDMS между двумя кусками большой липкой лентой при комнатной температуре. Для ранних и поздних третьих личинок в звезде, сократить PDMS на восемь на два на один миллиметр кубоидов, позиционирование паз, созданный лентой полосы в центре длинной стороне кубоида.
Для второй личинки звезды, сократить кубоид до восьми на один на один миллиметр. Чтобы подготовить верхнюю крышку скольжения для монтажа, выберите шесть PDMS кубоидов с канавками, соответствующие размерам личинок. Удалите пыль с поверхности PDMS с липкой лентой.
Прикрепите четыре куска двойной односторонней ленты размером 12 на пять миллиметров на длинной крышке скольжения 22 на 50 миллиметров для фиксации PDMS кубоидов позже. Отрегулируйте пробелы между двумя кусками двухсторонней ленты до такой же, как ширина паза PDMS. Нанесите небольшую каплю УФ-клея в паз каждого кубоида PDMS и добавьте шесть небольших капель УФ-клея в пространство между двусторонними лентами на крышке скольжения.
Чтобы подготовить личинки к монтажу, используя пару типсов, очистите личинки в воде, чтобы удалить пищу с поверхности тела. Поместите чистых личинок на небольшой кусок увлажненной бумаги ткани в небольшой чашке Петри без крышки и поместите небольшую чашку Петри в большую чашку Петри, содержащую кусок сухой бумаги ткани. В химическом капюшоне используйте пластиковую перенесите пипетку, чтобы нанесите от 160 до 240 микролитров изофлюрана на сухую бумагу и закройте крышку большой чашки Петри.
Подождите две-три минуты, отслеживая личинки. Как только их крючки для рта перестанут двигаться, вынули личинки из большой чашки Петри. Поместите обездвиженные личинки на УФ-клей между двусторонними лентами на крышке скольжения с спинной кутикулы перед крышкой скольжения.
Обложка каждой личинки с блоком PDMS и подходят ствол личинки в паз PDMS. Оставьте голову и хвост личинки за пределами канавки PDMS. Избегайте блокирования spiracles личинки клеем.
Нажмите вниз на концах блока PDMS на двустороннюю ленту, не применяя силу на паз. Аккуратно потяните за хвост личинки, чтобы сгладить кутикулу под PDMS. Носите защитные очки и используйте портативный УФ-лампы для лечения УФ-клея в течение четырех минут на высокой настройки.
Переверните крышку скольжения вверх дном и использовать УФ-лампу для лечения УФ-клея в течение еще четырех минут. Поместите небольшой кусок бумаги объектива размером 15 на 30 миллиметров в нижней части камеры визуализации. Смочить бумагу с 20 до 30 микролитров воды.
Поместите крышку скольжения на камеру так, что личинки сталкиваются внутри камеры. Используйте УФ-клей, чтобы приклеить оба конца крышки скольжения к металлической поверхности. Спинная сторона личинок готова к визуализации под конфокальным микроскопом.
После изображения снимите масло на верхней крышке скольжения с помощью бумаги объектива. Отсоедините верхнюю крышку от металлической рамы, разрезая пространство между крышкой скольжения и металлический каркас с лезвием бритвы. Камера визуализации готова к повторной использованию.
Отсоедините кубоиды PDMS от верхней крышки скольжения с типсами. Roll PDMS кубоидов на липкой ленте, чтобы удалить остатки клея и пыли. Кубоиды PDMS готовы к повторного использованию.
В этом протоколе личинки дрозофилы были обездвижены в течение более 10 часов для непрерывной визуализации. На этом рисунке показаны шесть поздних третьих звездных личинок, установленных в камере. Стволы личинок были зафиксированы в то время как их головы и хвосты были свободны в движении.
Здесь мы демонстрируем применение LarvaSPA в изучении динамики дендрита нейронов и дегенерации дендрита с использованием нейронов 4 класса DA в качестве модели. Чтобы успешно обездвижить личинок с помощью этого метода, очень важно, чтобы остановить подвергая личинок изофлуран, как только рот крючки остановить движение и вылечить УФ-клей, прежде чем личинки полностью проснуться. Для изучения дендритной дегенерации и регенерации, лазерная травма может быть выполнена, когда личинки обездвижены в камере визуализации.
LarvaSPA помогла нам понять, как динамические растущие дендриты не в состоянии иннерватных эпидермальных клеток, как в печеночные клетки протеогликанов и как фосфатидилсерин подвергается на вырождающихся дендритов после лазерной травмы. Защитите глаза защитными очками при использовании УФ-лампы. Выбивание личинок с помощью изофлюрана должно выполняться в дымовом капюшоне.
