LarvaSPA é o primeiro método que permite imagens vivas contínuas de larvas de drosophila intactas por mais de 10 horas com alta resolução temporal e espacial. Este método é usado para revelar processos celulares dinâmicos de neurônios sensoriais periféricos larvas e para estudar muitos outros processos celulares que acontecem perto da parede corporal da larva. Este método é fácil de usar e tem menor limitação no tamanho da larva.
Seis a nove larvas podem ser montadas na câmara de imagem ao mesmo tempo, o que torna o experimento possível. A câmara de imagem dos cuboides PDMS pode ser fabricada a um custo mínimo e são reutilizáveis. Este método é particularmente útil para estudar mecanismos de desenvolvimento dendrito e degeneração dendrito usando neurônios de autorização dendrítica de larvas desndríticas de drosophila.
Ser capaz de imaginar o mesmo neurônio por horas pode revelar como as mudanças globais de longo prazo dos padrões dendríticas surgem de comportamentos de curto prazo no nível de ramificação individual. O uso de cuboides PDMS que correspondem aos tamanhos das larvas aumentará a taxa de sucesso das larvas imobilizadoras. Por favor, encontre fitas mais úteis em nossa seção de solução de problemas.
Depois de construir um bloco de alumínio de uma oficina mecânica, sele a parte inferior da estrutura metálica usando um longo deslizamento de tampa com cola UV. Cure a pista UV usando uma lâmpada UV portátil por 30 segundos. Conecte camadas de fita de embalagem à superfície interna de uma placa de Petri retangular ou placa de cultura celular redonda.
Use uma camada para segunda larvas in-star, duas camadas para larvas in-star no início do terceiro quarto, ou três camadas para larvas in-star no final da terceira rodada. Corte a fita em viagens de largura específica com uma lâmina de barbear, 1,5 milímetros para uma fita de camada e dois milímetros para a fita de duas camadas ou três camadas. Deixe pelo menos um espaço de cinco milímetros entre as duas tiras.
Remova as camadas de fita que cobrem o espaço. Remova o pó da superfície interna da placa usando fita adesiva. Depois disso, o molde está pronto para uso.
Para preparar a mistura PDMS, misture sete gramas de base PDMS em 0,7 gramas de agente de cura completamente em um recipiente pequeno. Coloque o recipiente em um desiccador a vácuo por pelo menos 15 minutos para remover o ar da mistura. Despeje lentamente cerca de 5,5 gramas de mistura PDMS sobre o molde para atingir uma espessura de um a dois milímetros.
Coloque a mistura de PDMS no desiccador a vácuo novamente por pelo menos 15 minutos para remover as bolhas de ar restantes da mistura. Quebre as últimas bolhas com uma ponta de pipeta. Cure o PDMS em uma superfície plana em uma incubadora de calor a 65 graus Celsius por duas horas.
Em seguida, use uma lâmina de barbear para soltar o PDMS curado ao longo da borda do molde e desprestá-lo do molde. Armazene o PDMS entre dois pedaços de fita adesiva grande à temperatura ambiente. Para as larvas in-star precoce e tardia, corte o PDMS em oito por dois por um milímetro cuboides, posicionando o sulco criado pela tira de fita no centro do lado longo do cuboide.
Para a segunda larva in-star, corte o cuboide para oito por um milímetro. Para preparar o deslizamento da tampa superior para montagem, escolha seis cuboides PDMS com ranhuras que combinem com os tamanhos das larvas. Remova o pó da superfície do PDMS com fita adesiva.
Conecte quatro peças de fita dupla face no tamanho de 12 por cinco milímetros em um longo deslizamento de cobertura de 22 por 50 milímetros para fixar cuboides PDMS mais tarde. Ajuste os espaços entre as duas peças de fita dupla face para a mesma largura do sulco PDMS. Aplique uma pequena gota de cola UV no sulco de cada cuboide PDMS e adicione seis pequenas gotas de cola UV no espaço entre as fitas duplas laterais no deslizamento da tampa.
Para preparar as larvas para montagem, usando um par de fórceps, limpe as larvas na água para remover alimentos da superfície do corpo. Coloque as larvas limpas em um pequeno pedaço de papel de tecido umedecido em uma pequena placa de Petri sem tampa e coloque a pequena placa de Petri em uma grande placa de Petri contendo um pedaço de papel de tecido seco. Em uma capa química, use uma pipeta de transferência de plástico para aplicar 160 a 240 microliters de isoflurane no papel de tecido seco e feche a tampa da grande placa de Petri.
Espere de dois a três minutos enquanto monitora as larvas. Uma vez que seus ganchos de boca parem de se mover, tire as larvas da grande placa de Petri. Coloque as larvas imobilizadas sobre a cola UV entre as fitas duplas laterais no deslizamento da tampa com a cutícula dorsal voltada para o deslizamento da tampa.
Cubra cada larva com um bloco PDMS e coloque o tronco da larva na ranhura do PDMS. Deixe a cabeça e a cauda da larva fora da ranhura PDMS. Evite bloquear os espirros da larva pela cola.
Pressione para baixo nas extremidades do bloco PDMS na fita dupla face sem aplicar força na ranhura. Puxe suavemente a cauda da larva para achatar a cutícula sob o PDMS. Use óculos de segurança e use uma lâmpada UV portátil para curar a cola UV por quatro minutos no ajuste superior.
Vire a tampa de cabeça para baixo e use a lâmpada UV para curar a cola UV por mais quatro minutos. Coloque um pequeno pedaço de papel de lente com o tamanho de 15 por 30 milímetros na parte inferior da câmara de imagem. Umedeça o papel com 20 a 30 microliters de água.
Coloque o deslizamento de tampa na câmara para que as larvas estejam voltadas para o interior da câmara. Use a cola UV para aderir ambas as extremidades do deslizamento da tampa à superfície metálica. O lado dorsal das larvas está pronto para a imagem sob um microscópio confocal.
Após a imagem, remova o óleo na tampa superior usando papel de lente. Retire o deslizamento da tampa superior da estrutura metálica cortando o espaço entre o deslizamento da tampa e a estrutura metálica com uma lâmina de barbear. A câmara de imagem está pronta para reutilização.
Retire os cuboides PDMS do deslizamento da tampa superior com fórceps. Enrole os cuboides PDMS em fita adesiva para remover resíduos de cola e poeira. Os cuboides PDMS estão prontos para reutilização.
Neste protocolo, as larvas de drosophila foram imobilizadas por mais de 10 horas para imagens contínuas. Este número mostra seis terceiras larvas in-star montadas na câmara. Os troncos das larvas foram consertados enquanto suas cabeças e caudas estavam livres para se mover.
Aqui, demonstramos a aplicação do LarvaSPA no estudo da dinâmica do dendrite neuronal e da degeneração do dendrite usando como modelo os neurônios da classe quatro DA. Para imobilizar com sucesso as larvas usando este método, é fundamental parar de expor as larvas ao isoflurane uma vez que os ganchos da boca parem de se mover e curem a cola UV antes que as larvas acordem completamente. Para estudar a degeneração e regeneração do dendrite, a lesão a laser pode ser realizada quando as larvas são imobilizadas na câmara de imagem.
LarvaSPA nos ajudou a entender como dendritos de crescimento dinâmicos não inervam células epidérmicas como em proteóglicanos de células hepáticas e como a fosfatidíseraina é exposta em dendritos degenerados após lesões a laser. Proteja os olhos com óculos de segurança enquanto usa a lâmpada UV. As larvas que usam isoflurane devem ser realizadas em um capô de fumaça.
