LarvaSPA è il primo metodo che consente l'imaging vivo continuo di larve di drosophila intatte per più di 10 ore con alta risoluzione temporale e spaziale. Questo metodo viene utilizzato per rivelare processi cellulari dinamici di neuroni sensoriali periferici delle larve e per studiare molti altri processi cellulari che si verificano vicino alla parete corporea della larva. Questo metodo è facile da usare e ha meno limiti sulle dimensioni della larva.
Da sei a nove larve possono essere montate nella camera di imaging contemporaneamente, il che rende possibile l'esperimento. La camera di imaging dei cuboidi PDMS può essere prodotta a un costo minimo e riutilizzabile. Questo metodo è particolarmente utile per lo studio dei meccanismi di sviluppo della dendrite e della degenerazione della dendrite utilizzando neuroni di autorizzazione dendritica della larva di drosophila.
Essere in grado di immaginare lo stesso neurone per ore può rivelare come i cambiamenti globali a lungo termine dei modelli dendritici derivano da comportamenti a breve termine a livello di singolo ramo. L'uso di cuboidi PDMS che corrispondono alle dimensioni delle larve aumenterà il tasso di successo delle larve immobilizzanti. Si prega di trovare nastri più utili nella nostra sezione risoluzione dei problemi.
Dopo aver costruito un blocco di alluminio da un'officina meccanica, sigillare il fondo del telaio metallico utilizzando un lungo coperchio scivolare con colla UV. Curare l'indizio UV utilizzando una lampada UV portatile per 30 secondi. Attaccare strati di nastro adesivo alla superficie interna di una piastra di Petri rettangolare o di una piastra di coltura cellulare rotonda.
Usa uno strato per le seconde larve in stelle, due strati per le prime terze larve stellate o tre strati per le larve in stelle della terza fine. Tagliare il nastro in viaggi di larghezza specifica con una lama di rasoio, 1,5 millimetri per il nastro a uno strato e due millimetri per il nastro a due o tre strati. Lasciare almeno cinque millimetri di spazio tra le due strisce.
Rimuovere i livelli del nastro che coprono lo spazio. Rimuovere la polvere dalla superficie interna della piastra utilizzando nastro adesivo. Successivamente, lo stampo è pronto per l'uso.
Per preparare il mix PDMS, mescolare sette grammi base PDMS in 0,7 grammi di agente polimerizzante accuratamente in un piccolo contenitore. Mettere il contenitore in un essiccatore sottovuoto per almeno 15 minuti per rimuovere l'aria dalla miscela. Versare lentamente circa 5,5 grammi di miscela PDMS sullo stampo per raggiungere uno o due millimetri di spessore.
Mettere nuovamente la miscela PDMS nell'essiccatore sottovuoto per almeno 15 minuti per rimuovere le bolle d'aria rimanenti dalla miscela. Rompi le ultime bolle con una punta di pipetta. Curare il PDMS su una superficie piana in un incubatore di calore a 65 gradi Celsius per due ore.
Successivamente, utilizzare una lama di rasoio per allentare il PDMS polimeri lungo il bordo dello stampo e staccarlo dallo stampo. Conservare il PDMS tra due pezzi di grande nastro adesivo a temperatura ambiente. Per le larve a stella precoce e tardiva terza, tagliare il PDMS in cuboidi otto per due per un millimetro posizionando il solco creato dalla striscia a nastro al centro del lato lungo del cuboide.
Per le seconde larve a stella, tagliare il cuboide a otto per uno per un millimetro. Per preparare lo scivolo di copertura superiore per il montaggio, scegli sei cuboidi PDMS con scanalature corrispondenti alle dimensioni delle larve. Rimuovere la polvere dalla superficie del PDMS con nastro adesivo.
Attaccare quattro pezzi di nastro a doppia mano delle dimensioni di 12 per cinque millimetri su un lungo slittamento di copertura di 22 per 50 millimetri per fissare i cuboidi PDMS in seguito. Regolare gli spazi tra i due pezzi di nastro a doppia mano sulla stessa larghezza della scanalatura PDMS. Applicare una piccola goccia di colla UV nella scanalatura di ogni cuboide PDMS e aggiungere sei piccole gocce di colla UV nello spazio tra i nastri a doppia parte sullo slittamento del coperchio.
Per preparare le larve per il montaggio, usando un paio di forcep, pulire le larve in acqua per rimuovere il cibo dalla superficie corporea. Posizionare le larve pulite su un piccolo pezzo di carta velina inumidita in una piccola piastra di Petri senza coperchio e posizionare la piccola piastra di Petri in una grande piastra di Petri contenente un pezzo di carta velina secca. In una cappa chimica, utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per applicare da 160 a 240 microlitri di isoflurane sulla carta velina secca e chiudere il coperchio della grande piastra di Petri.
Attendere da due a tre minuti durante il monitoraggio delle larve. Una volta che i loro ganci per la bocca smettono di muoversi, esezioni dalle larve dalla grande piastra di Petri. Posizionare le larve immobilizzate sulla colla UV tra i nastri a doppia lato sul coperchio scivolare con la cuticola dorsale rivolta verso lo scivolo di copertura.
Coprire ogni larva con un blocco PDMS e inserire il tronco della larva nel solco del PDMS. Lasciare la testa e la coda della larva fuori dal solco PDMS. Evitare di bloccare gli spiracoli della larva dalla colla.
Premere verso il basso sulle estremità del blocco PDMS sul nastro a doppia lato senza applicare forza sulla scanalatura. Tirare delicatamente sulla coda della larva per appiattire la cuticola sotto il PDMS. Indossare occhiali di sicurezza e utilizzare una lampada UV portatile per curare la colla UV per quattro minuti sull'impostazione alta.
Capovolgere il coperchio e utilizzare la lampada UV per curare la colla UV per altri quattro minuti. Posizionare un piccolo pezzo di carta per lenti con dimensioni di 15 per 30 millimetri nella parte inferiore della camera di imaging. Inumidire la carta con da 20 a 30 microlitri d'acqua.
Posizionare il coperchio scivolare sulla camera in modo che le larve siano rivolte verso l'interno della camera. Utilizzare la colla UV per aderire a entrambe le estremità del coperchio scivolare sulla superficie metallica. Il lato dorsale delle larve è pronto per l'imaging al microscopio confocale.
Dopo l'imaging, rimuovere l'olio sul coperchio superiore scivolare utilizzando la carta dell'obiettivo. Staccare lo scivolo del coperchio superiore dal telaio metallico tagliando nello spazio tra lo scivolo del coperchio e il telaio metallico con una lama di rasoio. La camera di imaging è pronta per il riutilizzo.
Staccare i cuboidi PDMS dal coperchio superiore scivolare con forcelle. Arrotolare i cuboidi PDMS su nastro adesivo per rimuovere residui di colla e polvere. I cuboidi PDMS sono pronti per il riutilizzo.
In questo protocollo, le larve di drosophila sono state immobilizzate per più di 10 ore per l'imaging continuo. Questa figura mostra sei larve in stelle di fine terzo montate nella camera. I tronchi delle larve erano fissi mentre la testa e la coda erano libere di muoversi.
Qui, dimostriamo l'applicazione di LarvaSPA nello studio della dinamica della dendrite neuronale e della degenerazione della dendrite usando i neuroni DA di classe quattro come modello. Per immobilizzare con successo le larve usando questo metodo, è fondamentale smettere di esporre le larve all'isoflurane una volta che i ganci della bocca smettono di muoversi e curare la colla UV prima che le larve si sveglino completamente. Per studiare la degenerazione e la rigenerazione della dendrite, la lesione laser può essere eseguita quando le larve sono immobilizzate nella camera di imaging.
LarvaSPA ci ha aiutato a capire come i dendriti dinamici in crescita non riescano a innervare cellule epidermiche come nei proteoglicani delle cellule epatiche e come la fosfatidilserina sia esposta su dendriti degenerativi dopo lesioni laser. Proteggere gli occhi con occhiali di sicurezza durante l'utilizzo della lampada UV. Eliminare le larve usando l'isoflurane deve essere eseguito in una cappa aspirante.
