애벌레SPA는 높은 시간적 및 공간 해상도로 10 시간 이상 동안 그대로 drosophila 애벌레의 지속적인 라이브 이미징을 허용하는 첫 번째 방법입니다. 이 방법은 유충 말초 감각 뉴런의 동적 세포 과정을 공개하고 애벌레 바디 월 근처에서 일어나는 많은 다른 세포 과정을 연구하는 데 사용됩니다. 이 방법은 사용하기 쉽고 애벌레 크기에 대한 제한이 적습니다.
6~9개의 애벌레는 이미징 챔버에 동시에 장착될 수 있어 실험을 가능하게 한다. PDMS cuboids의 이미징 챔버는 최소한의 비용으로 제조 될 수 있으며 재사용 가능합니다. 이 방법은 drosophila 애벌레 수지상 승인 뉴런을 사용하여 민들레 발달 및 말단 변성의 메커니즘을 연구하는 데 특히 유용합니다.
시간 동안 동일한 뉴런을 이미지화할 수 있다는 것은 개별 분기 수준에서 단기 적인 행동에서 수지상 패턴의 장기적인 글로벌 변화가 얼마나 오래 발생하는지 알 수 있습니다. 애벌레의 크기에 맞는 PDMS cuboids를 사용하면 유충의 성공률이 높아집니다. 문제 해결 섹션에서 더 유용한 테이프를 찾아보십시오.
기계 가게에서 알루미늄 블록을 생성 한 후, UV 접착제긴 커버 슬립을 사용하여 금속 프레임의 바닥을 밀봉. 핸드헬드 UV 램프를 사용하여 30초 동안 UV 단서를 치료합니다. 직사각형 페트리 접시 또는 둥근 세포 배양 판의 내부 표면에 포장 테이프층을 부착합니다.
두 번째 별 애벌레에 1 층, 초기 세 번째 별 애벌레에 대한 두 층, 또는 세 번째 별 애벌레에 대한 세 층을 사용합니다. 테이프를 면도날로 특정 폭의 이동으로 자르고, 1층 테이프의 경우 1.5밀리미터, 2층 또는 3층 테이프의 경우 2밀리미터를 줄입니다. 두 스트립 사이에 적어도 5밀리미터 의 공간을 둡니다.
공간을 덮는 테이프 레이어를 제거합니다. 끈적끈적한 테이프를 사용하여 플레이트 의 내부 표면에서 먼지를 제거합니다. 그 후, 금형은 사용할 준비가되어 있습니다.
PDMS 믹스를 준비하려면 7 그램 PDMS 베이스를 0.7 그램의 경화제를 작은 용기에 완전히 섞습니다. 혼합물에서 공기를 제거하기 위해 적어도 15 분 동안 진공 건조기에 용기를 놓습니다. 약 5.5그램의 PDMS 혼합물을 금형에 천천히 부어 1~2밀리미터 두께에 도달합니다.
PDMS 혼합물을 진공 건조기에 다시 넣고 혼합물에서 남은 기포를 제거하기 위해 적어도 15분 동안 다시 배치합니다. 파이펫 팁으로 마지막 몇 개의 거품을 끊습니다. 2시간 동안 섭씨 65도의 열 인큐베이터에서 평평한 표면의 PDMS를 치료합니다.
그런 다음 면도날을 사용하여 금형 가장자리를 따라 경화 된 PDMS를 풀고 금형에서 분리합니다. 실온에서 큰 끈적 끈적한 테이프 두 조각 사이에 PDMS를 저장합니다. 3차 스타 애벌레의 경우, 양포형의 긴 면 중앙에 테이프 스트립이 만든 홈을 배치하여 PDMS를 8x 2x 1mm 의 큐비드로 자른다.
두 번째 별 애벌레의 경우, 1 밀리미터에 의해 8로 cuboid를 잘라. 장착을 위한 상단 커버 슬립을 준비하려면 애벌레의 크기와 일치하는 홈이 있는 6개의 PDMS 큐코이드를 선택합니다. 스티커 테이프로 PDMS 표면에서 먼지를 제거합니다.
나중에 PDMS cuboids를 고정하기 위해 22 x 50mm의 긴 커버 슬립에 12 x 5 mm 크기의 양면 테이프 4 개를 부착하십시오. 양면 테이프의 두 조각 사이의 공간을 PDMS 홈의 너비와 동일하게 조정합니다. 각 PDMS 큐비드의 홈에 UV 접착제의 작은 방울을 적용하고 커버 슬립에 양면 테이프 사이의 공간에 UV 접착제의 여섯 작은 방울을 추가합니다.
장착을 위해 애벌레를 준비하려면, 한 쌍의 포셉을 사용하여, 몸 표면에서 음식을 제거하기 위해 물에 애벌레를 청소하십시오. 깨끗한 유충을 작은 페트리 접시에 뚜껑없이 작은 페트리 접시에 넣고 작은 페트리 접시를 마른 티슈 페이퍼가 들어 있는 큰 페트리 접시에 넣습니다. 화학 후드에서 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 160~240마이크로리터의 이소플루란을 건조 티슈 용지에 바르고 큰 페트리 접시의 뚜껑을 닫습니다.
애벌레를 모니터링하는 동안 2 ~3 분 기다립니다. 입갈고리가 움직이지 않는 후, 큰 페트리 접시에서 애벌레를 꺼내라. 커버 슬립의 양면 테이프 사이에 고정된 애벌레를 UV 접착제에 놓고 등쪽 큐티클이 커버 슬립을 향합니다.
각 애벌레를 PDMS 블록으로 덮고 유충의 트렁크를 PDMS의 홈에 맞춥시게 합니다. PDMS 홈 바깥에 애벌레의 머리와 꼬리를 둡니다. 접착제에 의해 애벌레의 첨탑을 차단하지 마십시오.
홈에 힘을 가하지 않고 양면 테이프에 PDMS 블록의 끝을 누릅니다. 유충의 꼬리를 부드럽게 당겨 PDMS 아래의 큐티클을 평평하게 합니다. 안전 안경을 착용하고 핸드헬드 UV 램프를 사용하여 높은 환경에서 4 분 동안 UV 접착제를 치료하십시오.
커버를 거꾸로 뒤집어 UV 램프를 사용하여 UV 접착제를 4분 더 치료합니다. 이미징 챔버 의 바닥에 15 x 30 밀리미터크기의 작은 렌즈 용지를 놓습니다. 20~30마이크로리터의 물로 종이를 적분시합니다.
애벌레가 챔버 의 내부를 향하고 있도록 챔버에 덮개 슬립을 놓습니다. UV 접착제를 사용하여 커버의 양쪽 끝을 금속 표면에 부착하십시오. 애벌레의 등쪽 면은 공초점 현미경의 밑에 화상 진찰을 위한 준비가 됩니다.
이미징 후 렌즈 용지를 사용하여 상단 커버 슬립의 오일을 제거합니다. 커버 슬립과 면도날의 금속 프레임 사이의 공간으로 절단하여 상단 커버 슬립을 금속 프레임에서 분리합니다. 이미징 챔버는 재사용할 준비가 되어 있습니다.
상단 커버 슬립에서 PDMS 큐파이드를 집게로 분리합니다. 접착제 잔류물과 먼지를 제거하기 위해 끈적 끈적한 테이프에 PDMS 큐비드를 굴려. PDMS 큐코이드는 재사용할 준비가 되어 있습니다.
이 프로토콜에서, drosophila 애벌레는 연속적인 화상 진찰을 위해 10 시간 이상 동안 고정되었습니다. 이 그림은 챔버에 장착 된 여섯 늦은 세 번째 별 애벌레를 보여줍니다. 유충의 트렁크는 고정되어 있었고, 머리와 꼬리는 자유롭게 움직일 수 있었다.
여기서, 우리는 모델로 클래스 4 DA 뉴런을 사용하여 신경 원간 역동성과 원달수 변성을 연구에 애벌레SPA의 응용 프로그램을 보여줍니다. 이 방법을 사용하여 유충을 성공적으로 고정하려면 입 후크가 움직이지 못하게하고 유충이 완전히 일어나기 전에 UV 접착제를 치료하면 애벌레를 이소플루란에 노출시키는 것을 중단하는 것이 중요합니다. 원원기 변성 및 재생을 연구하기 위해, 레이저 부상은 애벌레가 이미징 챔버에서 고정될 때 수행될 수 있다.
LarvaSPA는 우리가 어떻게 역동적인 성장 하는 원더라이트 간 세포 proteoglycans에서 처럼 피감 세포 내면에 실패 하 고 어떻게 phosphatidylserine 레이저 부상 후 퇴행성 원더 라이트에 노출 이해 하는 데 도움이. UV 램프를 사용하는 동안 안전 안경으로 눈을 보호하십시오. 이소플루란을 사용하여 애벌레를 노크하는 것은 연기 후드에서 수행되어야한다.
