Este método pode responder à pergunta-chave sobre o papel do sistema imunológico inato na infecção pelo Clostridium, como se e como os macrófagos reconhecem ou fagocitam esse patógeno. A principal vantagem deste método é que ele pode ser aplicado a muitas bactérias anaeróbicas diferentes, que o tempo de infecção pode ser manipulado, e que a administração oral representa a infecção humana normal muito mais próxima. Depois de cultivar, transfira um mililitro da cultura em um cuvette espectrômetro, e meça o OD600.
Transfira a quantidade necessária para um tubo fresco de 1,5 mililitro, a fim de alcançar um OD final de 1 a 1,2 em um mililitro de volume final. Lave uma vez com um mililitro de 1X PBS, e centrífuga a 5.000 vezes g por três minutos em temperatura ambiente. Resuspend em um mililitro de 1X PBS.
Adicione três microliters de solução de trabalho do corante fluorescente preparado na suspensão bacteriana de um mililitro. Incubar a amostra por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Depois disso, lave o Clostridioides difficile manchado uma vez com 1X PBS para remover corante residual, e resuspend em um mililitro de 1X PBS para alcançar um OD600 de 1.0.
Primeiro, coloque uma queda de 0,8% de baixa derretimento agarose sobre as larvas de zebrafish em uma placa de Petri para cobrir. Ajuste suavemente as larvas para uma posição lateral. Coloque a placa de Petri no gelo por 30 a 60 segundos para permitir que a agarose de baixo derretimento se solidifique.
Adicione 30% o meio de Danieau contendo 0,02% a 0,04% tricaine para cobrir a agarose. Para preparar a solução de injeção, adicione um microliter de 0,5% de fenol vermelho na solução PBS em nove microliters do clostridioides difficile inoculum manchado de corante. Carregue uma agulha de microinjeção calibrada com a solução de injeção usando um Microcarregador.
Monte a agulha carregada em um micromanipulador, e posicione-a sob um microscópio estéreo. Ajuste a pressão de injeção entre 600 e 900 hectopascals. Defina o tempo de injeção para 0,1 a 0,3 segundos para obter nanolitadores de 0,5 a 1,0.
Coloque a agulha no micromanipulador em um ângulo de aproximadamente 45 graus, apontando para as larvas incorporadas. Coloque a ponta da agulha acima do trato gastrointestinal, perto do poro urogenital. Perfure a agarose, depois o músculo com a ponta da agulha.
Em seguida, insira-o no lúmen intestinal, e injete de 0,5 a 1,0 nanolitadores de Clostridioides difficile. Use um microscópio de fluorescência para monitorar as larvas injetadas e use uma ponta de Microloader flexível para pegar as larvas injetadas adequadamente para imagens confocal. Em uma placa de 1,5% de agarose com ranhuras, coloque uma queda de 0,8% de baixa derretimento nas larvas de zebrafish para cobrir.
Ajuste suavemente as larvas com cabeças viradas para a vertical em ângulos de 45 graus na ranhura e caudas contra a parede da ranhura. Opere suavemente a agulha através da agarose, depois na boca de larvas de zebrafish, através do esôfago. Uma vez que a ponta da agulha esteja dentro da lâmpada intestinal anterior, pressione o pedal de injeção para liberar 0,5 para um nanoliters da cultura das bactérias.
Encha o lúmen do intestino. Não deixe transbordar do esôfago ou cloaca. Retire suavemente a agulha da boca do zebrafish.
Após gavage, resgate as larvas de zebrafish infectadas da agarose com uma ponta de Microloader flexível cortando primeiro a agarose, depois levantando as larvas. Transfira essas larvas para o meio estéril de 30% de Danieau e enxágue duas vezes. Depois de anestesiar as larvas de zebrafish, adicione 200 a 300 microliters de 1% de baixa derretimento agarose para cobrir as larvas anestesiadas.
Coloque a região infectada das larvas contra uma lâmina de vidro o mais próximo possível. Deixe a agarose solidificar no gelo por 30 a 60 segundos. Submergir a agarose em 30% médio de Danieau contendo 0,02% a 0,04%.
Vá para a imagem das larvas com um microscópio de varredura a laser confocal. Depois de eutanásia das larvas de zebrafish infectadas, insira uma agulha no tronco dorsal de larvas de zebrafish perto da cabeça para imobilizar o zebrafish. Remova a cabeça atrás das brânquias com uma lanceta.
Insira uma segunda agulha no meio do tronco dorsal. Insira uma terceira agulha no abdômen do zebrafish, e puxe o intestino para fora da cavidade corporal. Use uma agulha de microinjeção para transferir 10 a 15 intestinos para um tubo de 1,5 mililitro contendo 200 microliters de PBS 1X estéreis.
Homogeneize os intestinos com um pilão para interromper o tecido e preparar homogeneizadores. Certifique-se de que o pilão chegue ao fundo do tubo para interromper completamente todos os intestinos. Nos homogeneizadores, adicione clostridioides difficile meio de criação contendo D-cicloserina e cefoxitina, com ou sem taurocholate, e incubar em uma câmara anaeróbica.
Neste estudo, tanto os neutrófilos quanto os macrófagos chegam aos locais de infecção. O exemplo de uma fagocitação de macrófago ativado duas bactérias mostra a clareira por fagocitose e digestão do clostridioides difuso rotulado. O microgavage para fornecer clostridioides rotulados de fluorescência difficile no lúmen intestinal das linhas de repórter macrófago e neutrófilo em cinco dias após a fertilização imita o caminho natural da infecção difficile clostridioides.
No entanto, neutrófilos e macrófagos não mostraram migração óbvia para o trato gastrointestinal por até 12 horas após a microgavage. Enquanto isso, a fluorescência do clostridioides difficile rotulado desapareceu após cerca de cinco horas após a microgavage. Amostras intestinais 24 horas após a infecção foram dissecadas e mostraram crescimento bacteriano.
Nenhuma bactéria cresceu no grupo controle. Posteriormente, as amostras incubadas só cresciam no meio contendo TCA, sugerindo que clostridioides totais difficile no intestino tinham formado esporos. 16S rDNA PCR identificou a bactéria cultivada como Clostridioides difficile, que produzem amplicons PCR específicos de tamanho previsível em torno de 800 pares de base.
As culturas bacterianas cultivadas em uma placa CHROMID apareceram como colônias negras típicas, o que indicou ainda que as bactérias dos intestinos de zebrafish eram clostridioides difficile. Trabalhar com bactérias anaeróbicas requer que os passos aeróbicos sejam mantidos curtos porque isso influencia a biologia das bactérias, é claro. Células imunes inatas em zebrafish podem ser manipuladas.
Por exemplo, eles podem decifrar o mecanismo das respostas das células imunes inatas à infecção. Nosso método indicou que o zebrafish pode ser uma ferramenta para estudar patógeno anaeróbico do intestino humano. Trabalhar com patógenos multi-resistentes requer que medidas de segurança apropriadas sejam tomadas.
