Bu yöntem, makrofajların bu patojeni tanıyıp tanıyabileceği veya fagositoze neden olduğu gibi Clostridium enfeksiyonunda doğuştan gelen bağışıklık sisteminin rolü hakkındaki temel soruyu yanıtlayabilir. Bu yöntemin ana avantajı birçok farklı anaerobik bakterilere uygulanabilir olmasıdır, enfeksiyon süresi manipüle edilebilir, ve oral uygulama çok daha yakın normal insan enfeksiyonu temsil eder. Kültürden sonra, kültürün bir mililitresini spektrofotometre cuvette'ine aktarın ve OD600'ü ölçün.
Son hacmin bir mililitresinde 1 ila 1,2'lik son bir OD'ye ulaşmak için gerekli miktarı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Bir mililitre 1X PBS ile bir kez yıkayın ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca 5,000 kez g santrifüj. 1X PBS bir mililitre resuspend.
Bir mililitrelik bakteriyel süspansiyon içine hazırlanan floresan boya çalışma çözeltisi üç mikrolitre ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca numune kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, lekeli Clostridioides difficile bir kez 1X PBS artık boya kaldırmak için yıkama ve 1X PBS bir mililitre resuspend bir OD600 elde etmek için 1.0.
İlk olarak, kapsayacak bir Petri kabında zebrabalığı larvaları üzerine% 0.8 düşük erime agarose bir damla yerleştirin. Larvaları yanal konuma hafifçe ayarlayın. Petri kabını 30-60 saniye boyunca buzun üzerine yerleştirin ve düşük eriyen agarose'un katılamasını bekleyin.
Agarose kapsayacak şekilde% 0.02 ila 0.04% tricaine içeren% 30 Danieau's orta ekleyin. Enjeksiyon çözeltisi hazırlamak için, boya lekeli Clostridioides difficile inoculum dokuz mikrolitre içine PBS çözeltisi% 0.5 fenol kırmızı bir mikrolitre ekleyin. Microloader kullanarak enjeksiyon çözeltisi ile kalibre edilmiş bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin.
Yüklü iğneyi bir mikromanipülatöre yerleştirin ve stereo mikroskop altında yerleştirin. Enjeksiyon basıncını 600 ile 900 hektopascal arasında ayarlayın. 0,5 ila 1,0 nanolitre elde etmek için enjeksiyon süresini 0,1 ila 0,3 saniye olarak ayarlayın.
İğneyi mikromanipülatöre yaklaşık 45 derecelik bir açıyla yerleştirin ve gömülü larvaları işaret edin. İğne ucunu gastrointestinal sistem üzerine, ürogenital gözeneğe yakın bir yere yerleştirin. Agarose'u del, sonra iğne ucuolan kasları.
Sonra bağırsak lümen içine yerleştirin ve Clostridioides difficile 0.5 ila 1.0 nanolitre enjekte. Enjekte edilen larvaları izlemek için floresan mikroskobu kullanın ve konfokal görüntüleme için düzgün enjekte edilen larvaları almak için esnek bir Microloader ucu kullanın. Olukları ile% 1.5 agarose plaka, kapsayacak şekilde zebrabalığı larvaları üzerine% 0.8 düşük eriyen agarose bir damla yerleştirin.
Larvaları, olukta 45 derecelik açılarda dik bakacak şekilde larvaları ve kuyrukları oluğun duvarına doğru yavaşça ayarlayın. İğneyi agarose'dan, sonra da yemek borusundan zebra balığı larvalarının ağzına doğru yavaşça çalıştırın. İğneucu ön bağırsak ampul içinde bir kez, bakteri kültürünün 0,5 bir nanolitre serbest bırakmak için enjeksiyon pedalına basın.
Bağırsağın lümenini doldurun. Yemek borusundan veya cloaca'dan taşmasına izin vermeyin. İğneyi zebra balığının ağzından yavaşça çekin.
Gavaj'ı takiben, enfekte zebra balığı larvalarını önce agarose'u keserek, sonra larvaları kaldırarak esnek bir Microloader ucuyla agarose'dan kurtarın. Bu larvaları steril %30 Danieau'nun orta makinesine aktarın ve iki kez durula. Zebra balığı larvalarını anestezi ettikten sonra, anestezili larvaları kapsayacak şekilde %1'lik düşük eriyen agarose'un 200 ila 300 mikrolitresini ekleyin.
Larvaların enfekte bölgesini mümkün olduğunca yakından cam bir kaydırağa karşı yerleştirin. Agarose 30-60 saniye buz üzerinde katılaşmak sağlar. Agarose%30 Danieau'nun %0,02 ila %0,04 trikotin içeren ortamına batırın.
Larvaları bir konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntüye devam edin. Enfekte zebra balığı larvaları ötenazi sonra, zebrabalığı larvaları baş yakın dorsal gövde içine bir iğne yerleştirin zebrabalığı hareketsiz hale getirmek için. Bir mızrak ile solungaçları arkasındaki baş çıkarın.
Sırt gövdesinin ortasına ikinci bir iğne yerleştirin. Zebra balığının karnına üçüncü bir iğne yerleştirin ve bağırsakları vücut boşluğundan çekin. 10 ila 15 bağırsakları 200 mikrolitre steril 1X PBS içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarmak için mikroenjeksiyon iğnesi kullanın.
Dokuyu bozmak ve homojenleri hazırlamak için bağırsakları bir zararlı ile homojenize edin. Tüm bağırsakları tamamen bozmak için haşere tüp altına ulaştığından emin olun. Homojenatlar içine, Clostridioides difficile yetiştirme orta D-sikloserin ve sefüsitin içeren ekleyin, veya taurokolate olmadan, ve bir anaerobik odada kuluçka.
Bu çalışmada hem nötrofiller hem de makrofajlar enfeksiyon bölgelerine ulaşabilmektedir. İki bakteriyi aktive eden makrofaj fagositizasyonu örneği, fagositoz ile temizlenmesini ve etiketli Clostridioides difficile'nin sindirimini göstermektedir. Flüoresans etiketli Clostridioides'in makrofaj ve nötrofil muhabir hatlarının bağırsak lümenine beş gün sonra döllenme sonrası yaygınlaşması, Clostridioids difficile enfeksiyonunun doğal yolunu taklit etmesi dir.
Ancak nötrofiller ve makrofajlar mikrogavajdan sonra 12 saate kadar gastrointestinal sistemde belirgin bir göç göstermediler. Bu arada, etiketli Clostridioides difficile floresan yaklaşık beş saat sonra mikrogavage sonra kayboldu. İnfeksiyon sonrası 24 saat bağırsak örnekleri incelenmiş ve bakteriyel büyüme göstermiştir.
Kontrol grubunda bakteri büyümedi. Daha sonraki zaman noktalarında, kuluçkaya yatan örnekler sadece TCA içeren ortamda büyüdü, bu da bağırsaktaki total Clostridioides difficile'nin sporlar oluşturduğunu düşündürdü. 16S rDNA PCR clostridioides difficile olarak yetiştirilen bakteri tespit, hangi öngörülebilir boyutta özel PCR amplicons üretmek etrafında 800 baz çiftleri.
CHROMID plakası üzerine yetiştirilen bakteri kültürleri tipik siyah koloniler olarak ortaya çıktı, bu da zebra balığı bağırsaklarından gelen bakterilerin Clostridioides difficile olduğunu gösterdi. Anaerobik bakterilerle çalışmak aerobik adımların kısa tutulmasını gerektirir çünkü bu bakterilerin biyolojisini etkiler. Zebra balığıdoğuştan bağışıklık hücresi manipüle edilebilir.
Örneğin, enfeksiyona doğuştan gelen bağışıklık hücresi yanıtlarının mekanizmasını deşifre edebilirler. Yöntemimiz, zebra balığının insan bağırsanın anaerobik patojenini incelemek için bir araç olabileceğini gösterdi. Çok dirençli patojenlerle çalışmak için uygun güvenlik önlemlerinin alınması gerekmektedir.
