Questo metodo può rispondere alla domanda chiave sul ruolo del sistema immunitario innato nell'infezione da Clostridium, come se e come i macrofagi riconoscono o fagocitosi questo agente patogeno. Il vantaggio principale di questo metodo è che può essere applicato a molti batteri anaerobici diversi, che il tempo di infezione può essere manipolato e che la somministrazione orale rappresenta la normale infezione umana molto più vicina. Dopo la coltivazione, trasferire un millilitro della coltura in una cuvetta spettrofotometrica e misurare l'OD600.
Trasferire la quantità richiesta in un tubo fresco da 1,5 millilitri per raggiungere un OD finale da uno a 1,2 in un millilitro di volume finale. Lavare una volta con un millilitro di 1X PBS e centrifugare a 5.000 volte g per tre minuti a temperatura ambiente. Resuspend in un millilitro di 1X PBS.
Aggiungere tre microlitri di soluzione di lavoro del colorante fluorescente preparato nella sospensione batterica da un millilitro. Incubare il campione per 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Successivamente, lavare i Clostridioidi difficili macchiati una volta con 1X PBS per rimuovere il colorante residuo e rimorsi in un millilitro di 1X PBS per ottenere un OD600 di 1,0.
Per prima cosa, posiziona una goccia di agarosio a bassa fusione dello 0,8% sulle larve di zebrafish in una piastra di Petri da coprire. Regolare delicatamente le larve in posizione laterale. Posizionare la piastra di Petri sul ghiaccio per 30-60 secondi per consentire all'agarosio a bassa fusione di solidificarsi.
Aggiungere il supporto del 30%Danieau contenente da 0,02% a 0,04%tricaina per coprire l'agarosio. Per preparare la soluzione di iniezione, aggiungere un microlitro dello 0,5% rosso fenolo in soluzione PBS in nove microlitri dei Clostridioides difficile inoculum macchiati di colorante. Caricare un ago di microiniezione calibrato con la soluzione di iniezione utilizzando un microloader.
Montare l'ago caricato in un micromanipolatore e posizionarlo al microscopio stereo. Regolare la pressione di iniezione tra 600 e 900 ettopascal. Impostare il tempo di iniezione su 0,1 a 0,3 secondi per ottenere da 0,5 a 1,0 nanolitri.
Impostare l'ago nel micromanipolatore con un angolo di circa 45 gradi, puntando verso le larve incorporate. Posizionare la punta dell'ago sopra il tratto gastrointestinale, vicino al poro urogenitale. Perforare l'agarosio, quindi il muscolo con la punta dell'ago.
Quindi inserirlo nel lume intestinale e iniettare da 0,5 a 1,0 nanolitri di Clostridioides difficile. Utilizzare un microscopio a fluorescenza per monitorare le larve iniettate e utilizzare una punta flessibile del microloader per raccogliere le larve correttamente iniettate per l'imaging confocale. In una piastra di agarosio all'1,5% con scanalature, posizionare una goccia di agarosio a bassa fusione dello 0,8% sulle larve di zebrafish da coprire.
Regolare delicatamente le larve con la testa rivolta verso l'alto ad angoli di 45 gradi nella scanalatura e nelle code contro la parete della scanalatura. Aziona delicatamente l'ago attraverso l'agarosio, quindi nella bocca delle larve di zebrafish, attraverso l'esofago. Una volta che la punta dell'ago si trova all'interno del bulbo intestinale anteriore, premere il pedale di iniezione per rilasciare da 0,5 a un nanolitri di coltura batterica.
Riempire il lume dell'intestino. Non lasciare che trabocca dall'esofago o dalla cloaca. Ritirare delicatamente l'ago dalla bocca del pesce zebra.
Dopo il gavage, salva le larve di zebrafish infette dall'agarosio con una punta flessibile del Microloader tagliando prima l'agarosio, quindi sollevando le larve. Trasferire queste larve nel mezzo sterile del 30% danieau e risciacquare due volte. Dopo aver anestetizzato le larve di zebrafish, aggiungere da 200 a 300 microlitri di agarosio a bassa fusione dell'1% per coprire le larve anestetizzate.
Posizionare la regione infetta delle larve contro uno scivolo di vetro il più vicino possibile. Lasciare solidificare l'agarosio sul ghiaccio per 30-60 secondi. Immergere l'agarosio nel mezzo del 30%Danieau contenente da 0,02% a 0,04%tricaina.
Procedi a imageare le larve con un microscopio a scansione laser confocale. Dopo aver eutanasiato le larve di zebrafish infette, inserire un ago nel tronco dorsale delle larve di zebrafish vicino alla testa per immobilizzare il pesce zebra. Rimuovere la testa dietro le branchie con una lancetta.
Inserire un secondo ago al centro del tronco dorsale. Inserire un terzo ago nell'addome del pesce zebra e estrarre l'intestino dalla cavità corporea. Utilizzare un ago di microiniezione per trasferire da 10 a 15 intestini in un tubo da 1,5 millilitri contenente 200 microlitri di PBS sterile 1X.
Omogeneizzare l'intestino con un pestello per interrompere il tessuto e preparare gli omogeneati. Assicurarsi che il pestello raggiunga il fondo del tubo per interrompere completamente tutto l'intestino. Negli omogeneati aggiungere clostridioidi difficile mezzo di allevamento contenente D-cicloscloserina e cefoxitina, con o senza taurocholato, e incubare in una camera anaerobica.
In questo studio, sia i neutrofili che i macrofagi raggiungono i siti di infezione. L'esempio di un macrofago attivato che fagocitizzare due batteri mostra la compensazione per fagocitosi e digestione dei Clostridioidi difficili etichettati. Il microgavage per fornire clostridioidi difficili con etichetta fluorescenza nel lume intestinale delle linee di macrofagi e neutrofili reporter a cinque giorni dopo la fecondazione imita il percorso naturale dell'infezione da Clostridioides difficile.
Tuttavia, neutrofili e macrofagi non hanno mostrato un'evidente migrazione al tratto gastrointestinale fino a 12 ore dopo il microgavage. Nel frattempo, la fluorescenza dei Clostridioidi difficile etichettati è scomparsa dopo circa cinque ore dopo il microgavage. Campioni intestinali 24 ore dopo l'infezione sono stati sezionati e hanno mostrato una crescita batterica.
Nessun batterio è cresciuto nel gruppo di controllo. In tempi successivi, i campioni incubati crebbero solo nel mezzo contenente TCA, suggerendo che i clostridioidi difficili totali nell'intestino avevano formato spore. 16S rDNA PCR ha identificato il batterio coltivato come Clostridioides difficile, che produce ampliconi PCR specifici di dimensioni prevedibili intorno a 800 coppie di basi.
Le colture batteriche coltivate su una piastra CHROMID apparivano come tipiche colonie nere, il che indicava inoltre che i batteri dell'intestino zebrafish erano Clostridioides difficile. Lavorare con i batteri anaerobici richiede che i passaggi aerobici siano mantenuti brevi perché ciò influenza la biologia dei batteri ovviamente. La cellula immunitaria innata nei pesci zebra può essere manipolata.
Ad esempio, possono decifrare il meccanismo delle risposte innate delle cellule immunitarie all'infezione. Il nostro metodo ha indicato che il pesce zebra può essere uno strumento per studiare l'agente patogeno anaerobico dall'intestino umano. Lavorare con agenti patogeni multiresiste richiede l'adozione di adeguate misure di sicurezza.
