Этот протокол высокой пропускной способности позволяет быстро скрининг саженцев помидоров от диких присоединений к бактериальному патогену Pseudomonas syringae. Анализ посевных наводнений сводит к минимуму время роста растений и потребности камеры роста, позволяет быстро оборот растений, и позволяет большие размеры выборки, которые будут проверены. Этот анализ является мощным инструментом, который может быть использован для проверки на устойчивость в диких присоединений и других линий со сложным генетическим фоном.
Протокол содержит конкретные направления для наводнений innoculation двух Pseudomonas syringae штаммов. Тем не менее, он является универсальным и может быть изменен для обнаружения устойчивости хозяина к другим бактериальным патогенам. Демонстрацией процедуры будет Яна Хасан, специалист по исследованиям в моей лаборатории.
Начните с выращивания саженцев помидоров. Поместите семена помидоров в 2,2 миллилитра микроцентрифуг трубки и добавить два миллилитров 50%отбеливатель раствора. Рок трубки в течение 25 минут, а затем удалить отбеливатель раствор с пипеткой.
Добавить два миллилитров ультра чистой воды и мыть семена, инвертирование трубки пять раз. Аспирировать жидкость из трубки, и повторить мыть еще четыре раза. После окончательной стирки добавьте два миллилитров ультра-чистой воды и вылейте семена в стерильную чашку Петри.
Стерилизовать миппы, пламяя их в этаноле затем использовать их для передачи от пяти до семи семян на 100 на 25 миллилитров пластины с 0,5 XMS плюс 0,8 процента агар-медиа. Запечатать края пластины хирургической лентой. Убедитесь, что пластины укладываются плоскими и лицом вверх.
Стратифицировать стерилизованные семена при четырех градусах по Цельсию в темноте, по крайней мере три дня, чтобы синхронизировать прорастание. Через три дня вертикально ориентируйте пластины так, чтобы корни росли вдоль поверхности пластины и линия семян ориентировалась горизонтально. Перенесите семена в камеру роста, установленную до 22 градусов по Цельсию с 16-часовым светом, 8-часовым темным циклом.
Выращивать саженцы в течение десяти дней в камере, после чего они, как правило, отображаются полностью появились и расширены cotyledons и возникающих первых истинных листьев. Полоса свежих бактерий на соответствующие КБ агар с плоской, стерильной зубочисткой. Для PstT1, инкубировать пластины при 28 градусов по Цельсию в течение 48 часов до использования бактерий в эксперименте наводнения.
Для подготовки инокулума, асептически resuspend бактерий в стерильных, десять миллимолярд хлорида магния к оптической плотности 0,1. Затем сделайте два серийных разбавления, чтобы получить рабочую концентрацию с OD600 из 0075. Также подготовить от одного до десяти разбавления неионных органосиликон серфактант кополимер в десять миллимолярд хлорида магния.
Vortex его и добавить его к бактериям, закрученного трубки для смешивания. Перенесите пластины с десятидневной рассадой из камеры роста в шкаф биобезопасности и удалите хирургическую ленту. Затем перенесите по шесть миллилитров инокулума на каждую тарелку.
Аккуратно нажмите саженцы в инокулум с кончиком пипетки и начать таймер в течение трех минут. Держите одну тарелку в каждой руке и наклоните переднюю часть пластины вниз, чтобы погрузить котилендоны и листья саженцев. Swish инокулум сторону в сторону пять-семь раз, а затем наконечник пластин обратно, чтобы покрыть корни с инокулем.
Наклоните пластины снова и повторите цикл в общей сложности три минуты. Налейте инокулум с тарелок, установите их на плоскую поверхность, и слить любой остаточный инокулум во второй раз. Переверните пластины и поместите их обратно в камеру роста.
Moneymaker-PtoR и Moneymaker-PtoS сорта были затоплены PSTDC3000 и фенотипированы через семь-десять дней после наводнения. Саженцы Moneymaker-PtoR несут генный кластер PtoPRF и устойчивы к PSTDC3000. В то время как почти изогенные саженцы Moneymaker-PtoS, которые не могут распознать эффекторы PSTDC3000 AVRPto или AVRPto-B, быстро погибли в течение семи дней после наводнения.
Десятидневные саженцы были затоплены PstT1 и фенотипированы по крайней мере через десять дней после наводнения. Восприимчивые присоединения были мертвы, имели коричневые апические меристемы и не хватало нового роста. В отличие от этого, устойчивые саженцы показали высокий уровень нового зеленого роста и пережили инфекцию PstT1.
Анализы роста бактерий были проведены для количественного подтверждения сопротивления PstT1 и Solanum NeoRici LA1329. Существовал 1,7 журнала разница в росте бактерий между устойчивыми и восприимчивыми LA1329 и 1,6 разница журнала между устойчивыми LA1329 и Moneymaker-PtoS, который коррелирует с фенотипическими результатами. При выполнении этого анализа, наиболее важные вещи, чтобы помнить, чтобы обратить пристальное внимание на асептические техники на протяжении всего протокола и обеспечить, чтобы все саженцы на тарелке тщательно затоплены.
Обязательно автоклав инфицированных тканей растений и бактерий и распоряжаться материалами в соответствии с соответствующими правилами.
