Этот протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет ученым выполнять простой генетический анализ бактериальной болезни увядание в томате. Основным преимуществом этой методики является то, что манипуляции экспрессией генов и последующими анализами могут быть выполнены в короткие сроки и с небольшими требованиями оборудования и пространства роста растений. Этот метод является очень универсальным, и он может быть применен к другим сельскохозяйственным растениям для выполнения как патогенной прививки, так и других физиологических анализов.
Для поддержания стерильности во время манипуляции саженцев в пробирке, важно держать пластины закрытыми, когда они находятся за пределами капота потока. Это простой метод, но он требует нескольких шагов для манипуляции. Визуализация этого метода поможет увидеть небольшие трюки, которые трудно объяснить в рукописи, помогая другим исследователям реализовать метод в своих лабораториях.
Помочь продемонстрировать эту процедуру будет Ахен Чжао, аспирант. После стерилизации и мытья семян помидоров, перенесите их в полу прочности Murashige и Skoog среднего без сахарозы. Держите семена в темноте при температуре от 25 до 28 градусов по Цельсию в течение трех дней.
Поместите автоматические фильтры площадью 8,5 квадратных сантиметров внутри тарелок Петри площадью 9 квадратных сантиметров, содержащих полупрочные Мурасиге и Скугскую среду, и поместите шесть проросших семян помидоров на каждую тарелку. Печать пластины с Micropore ленты, и инкубировать проросли семена при 25 до 28 градусов по Цельсию в течение трех-четырех дней. Выращивайте agrobacterium rhizogenes MSU440 в твердой среде LB с соответствующими антибиотиками в течение двух дней при 28 градусах Цельсия до преобразования растений.
Используя стерильный скальпель, вырежьте радикул и дно гипокотила саженцев помидоров. Используйте пластиковые наконечники или лезвие скальпеля для сбора биомассы A.rhizogenes с поверхности среды LB и тщательно окуните срезаные саженцы помидоров в бактериальную биомассу. После этого накройте саженцы помидоров полукруглой фильтровальной бумагой длиной два сантиметра на четыре сантиметра, чтобы поддерживать высокую влажность и способствовать выживанию и развитию новых корней.
Важно держать саженцы в высокой влажности в среде, которая позволяет транспирации. Для этого накройте рассаду фильтровальной бумагой и закройте тарелку лентой Micropore. Храните преобразованные саженцы помидоров в течение шести-семи дней в камере роста при температуре от 25 до 28 градусов по Цельсию.
Затем используйте стерильный скальпель, чтобы сократить новые новые волосатые корни, и позволяют саженцам производить новые волосатые корни. Как только появится второе поколение новых волосатых корней, удалите фильтровальную бумагу поверх рассады и снова запечатав пластину лентой Micropore. Чтобы визуализировать флуоресценцию DsRed или любое другое оборудование для визуализации растений in vivo, отметь положительные преобразованные корни, которые могут быть идентифицированы по красной флуоресценции.
Используйте скальпель, чтобы удалить отрицательные не преобразованные корни, которые могут быть определены по их отсутствию красной флуоресценции. Перенесите саженцы, которые показывают красную флуоресценцию, на новую пластину, содержащую полуплечную среду Мурашиге и Скуг, чтобы облегчить развитие преобразованного корня в качестве основного корня. Держите саженцы, которые не показывают красную флуоресценцию в той же пластине, чтобы проверить появление флуоресцентных корней в более поздних точках времени.
Обложка саженцы с двух сантиметров на четыре сантиметра полукруг фильтровальной бумаги, печать пластины, и инкубировать саженцы, чтобы позволить им разработать новые волосатые корни. Подготовка прививки горшки, где поверхность корней будут подвергаться бактериальной инокулы, сначала замачивания прививки горшки с водой, сливая излишки воды, а затем поместив их в пластиковый поднос посадки. Используя пинцет, перенесите отобранные саженцы с трансформироваными корнями в прививообразные горшки.
Обложка лоток с полиэтиленовой пленкой или прозрачной крышкой, и держать их на 25 до 28 градусов по Цельсию с 65%влажности. Снимите крышку через пять или шесть дней. Выращивать Ralstonia в пяти LB жидкой среде в орбитальном шейкере при 28 градусах по Цельсию, с встряхивания при 200 об/мин, до стационарной фазы.
Измерьте оптическую плотность на 600 нанометров, чтобы определить бактериальные числа. Разбавить бактериальную культуру водой до OD600 из 1. Поместите от 16 до 20 прививочные горшки, которые содержат преобразованные томатные растения в поднос для прививки.
Затем залить 300 миллилитров разбавленной бактериальной инокулы в лоток, и дать растениям замочить в инокуле в течение 20 минут. После этого приготовьте новый лоток с слоем почвы для заливки. Переместите привитые горшки в новый лоток и поместите лотки в камеру роста с влажностью 75%, температурой от 26 до 28 градусов по Цельсию и фотопериодом 12 часов света и 12 часов темноты.
Здесь, томатные корни преобразуются и привиты с Ralstonia для выполнения простого генетического анализа для изучения бактериальных заболеваний увядания. Развитие симптомов заболевания отслеживается в томатных растений с корнями превращается с пустым вектором и те, преобразованы с RAI построить ориентации помидор CESA6. Данные индекса заболевания собираются из одного и того же экспериментального подразделения с течением времени по произвольной шкале от нуля до четырех и не следуют гауссийского распределения, исключая использование стандартных тестов для параметрических данных.
В качестве стандартного подхода используется двуххвостый, не параметрический тест U Mann-Whitney для сравнения кривых контроля и инфекции. Согласно этому анализу, разница между медианами обеих кривых представляется несущественной. Кроме того, можно количественно области в рамках кривой прогресса болезни, что позволяет объединить несколько наблюдений прогресса болезни в одно значение.
Область под кривой прогресса болезни показывает более высокое значение для контрольных растений по сравнению с томатными растениями CESA6 РНК в конце инфекционного процесса, что указывает на то, что томатные растения CESA6-silenced более устойчивы к инфекции Ralstonia, чем контрольные установки. Интервалы доверия предлагают способ оценки, с высокой вероятностью, диапазона значений, в которых найдено значение популяции данной переменной. Как видно здесь, область 95%-ного интервала доверия для кривых контроля и инфекции оценивает более высокую вероятность резистентности, когда CESA6 заглушается.
Значения индекса болезни могут быть преобразованы в двоичные данные, учитывая индекс болезни ниже двух, соответствующих нулю, и индекс болезни, равный или выше двух, соответствующих одному. Это позволяет представление кривой выживания после прививки Ralstonia. Различия в выживаемости между контролем и инфицированных растений не являются статистически значимыми в соответствии с Gehan-Breslow-Wilcoxon статистического теста.
Выражение CESA6 затем анализируется в двух случайно выбранных преобразованных корней до прививки шаг, показывая, что повышенная устойчивость к Ralstonia коррелирует с уменьшенным выражением CESA6. После двух раундов отбора можно получить скорость трансформации от 35 до 40%, и это значение может быть увеличено путем выполнения дополнительных раундов отбора. При выполнении этой процедуры, важно, чтобы саженцы покрыты лист фильтровальной бумаги для поддержания высокой влажности и уплотнения пластин с Micropore для обеспечения обмена газа.
После преобразования корня, многие из методов лечения могут быть применены для изучения реакции растений путем наблюдения корневой физиологии или с использованием молекулярной биологии, клеточной биологии или биохимии. Главным образом, этот метод позволит исследователям с ограниченными ресурсами для выполнения генетического анализа бактериальной инфекции в томатных корнях.
