Общая цель этого протокола травмы Drosophila заключается в том, чтобы наблюдать как сохранение аксональной и синаптической морфологии, а также синаптической функции аксонов и их синапсов. Эти анализы также могут быть использованы для характеристики факторов поддержания нейронов, изучения аксонального транспорта или анализа аксональных органелл в нетронутых аксонах. Частичный анализ травмы крыла позволяет для наблюдения раненых аксонов, проходящих дегенерацию бок о бок с невредимыми аксонами управления в том же нервном пучок в крыле Drosophila.
Эта травма анализа можно легко практиковать заранее в диких мух типа, применяя разрез примерно в середине крыла с микро-ножницами. Внутренняя травма позволяет оценить аксональной морфологии и с помощью оптогенетики визуализировать функциональное сохранение аксона и их синапсов. Антеннель абляции требует устойчивых рук.
Также рекомендуется заранее практиковать удаление антенн у мух дикого типа. При зависимости любая доступная установка оптогенетики подходит для активации нейронов в мухе со шляпой. В противном случае, простая настройка может быть легко построена с нуля.
Для начала используйте пять девственных самок и пять самцов из правильного генотипа для выполнения крестов при комнатной температуре. Передача поколения P0 в новые флаконы каждые три-четыре дня. Собирайте свежевыбитое взрослое потомство поколения F1 ежедневно в новые флаконы и старейте их в течение семи-14 дней.
После обезболировки используйте микро-ножницы, чтобы вырезать внутреннюю вену крыла примерно в середине крыла. Используйте одно крыло для травмы, а другое крыло, как возраст соответствует невредимым контроля. Применить одну травму на крыло и убедитесь, что получить 15 крыльев ранения.
Восстановите мух в пище, содержащей флаконы. Далее, с пипеткой, распространение 10 микролитров галоуглеродного масла 27 вдоль целого стеклянного слайда. Один или семь дней после травмы, использовать микро-ножницы, чтобы отрезать раненых, а также невредимым крылом управления.
Используйте пинцет, чтобы захватить крыло в центре, смонтировать максимальные четыре крыла в галоуглеродное масло 27 и покрыть их крышкой слайда. Изображения GFP помечены нейронов в крыле можно легко приобрести с вращающимся диском. Тем не менее, время приобретения должно быть выполнено менее чем через восемь минут после монтажа крыльев, потому что блюдо не фиксируется.
Изображение крыла сразу же с помощью вращающегося дискового микроскопа. Приобрети ряд оптических секций вдоль оси q с размером шага 0,33 микрометра и сдавлимите стеки в один файл для последующего анализа. Крест пять девственных самок и пять мужчин из правого генотипа и собирать F1 поколения, как и раньше.
После анестезии используйте пинцет для расширения правого третьего сегмента антенны для односторонней абляции или как левого, так и правого третьего сегментов антенн для двусторонней абляции. Это удаляет GFP помечены нейрональных клеток органов в то время как их аксональные проекции остаются в ЦНС. В зависимости от GFP помечены нейронов, используемых в технике, важно знать, являются ли тела клеток размещены в третьем или во втором сегменте антенны для последующего анализа травмы.
Восстановите мух в пище, содержащей флаконы. После анестезии используйте пинцет, чтобы схватить шею и другой пинцет, чтобы исправить грудную клетку. Аккуратно потяните шею и отоголову от грудной клетки.
Используя пинцет, которые были окунуты в фиксаторный раствор, перенесите все головки в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку, содержащую один миллилитр фиксируя раствора 4%paraformaldehyde и 0,1 тритона X100 в PBS. Зафиксите головки в течение 20 минут с нежным возбуждением при комнатной температуре. Затем положите трубку микроцентрифуга на лед и головы тяготеют к нижней части микроцентрифуг трубки.
Удалите супернатант с пипеткой и добавьте один миллилитр стирального буфера, содержащего 0,1%тритон X100 в PBS. Поместите трубку на поворотное колесо при комнатной температуре для мытья в течение двух минут. Повторите мыть четыре дополнительных раза, чтобы удалить остаточный раствор фиксации.
После подготовки мозгов, получить крышку слайд, придерживаться лаборатории ленты на нем, и вырезать T, как форма из ленты. Используйте наконечник пипетки от 20 до 200 микролитров, где три миллиметра наконечника были отрезаны, чтобы расширить отверстие пипетки. Pipette мозг, содержащий антифад реагент на слайде и покрыть мозги с крышкой слайд.
Используйте глину, чтобы подготовить два небольших 3 рулонах. Убедитесь, что глиняные рулоны не выше высоты стеклянной горки. Stick глины рулонах на стеклянную горку и место мозга, содержащего крышку слайд бутерброд на глиняные рулоны.
Продолжить в соответствии с рукописью. Чтобы подготовить мух к оптогенетике, сначала растопить мухомолетную пищу в микроволновой печи. После того, как пища остынет, перед затвердевание, добавить 20 миллимоляров все транс-retinal в этаноле до окончательной концентрации 200 микромолей.
Хорошо перемешать и залить пищу сразу в пустые флаконы. Обложка флаконы, содержащие затверденные продукты питания с пробками или ватные шарики. Оберните флаконы алюминиевой фольгой.
Затем храните продукты, содержащие флаконы, в темной холодной комнате. Используйте пять девственных самок и пять самцов из правого генотипа для выполнения крестов при комнатной температуре и сбора F1 поколения, как ранее в алюминиевых флаконах, содержащих 200 микромолейных все транс-retinal в лету пищи. Затем соберите мух, нажав их из пищи, содержащей флаконы в пустой флакон без пищи.
Охладить флакон во льду, содержащем воду, в течение примерно 30 секунд. Мухи засыпают. Теперь быстро поместите отдельных мух в небольшие камеры, покрытые крышкой слайд для выполнения оптогенетики.
В темной комнате выполните протокол, состоящий из 30 секунд, где отсутствует красный свет, а затем 10 секунд воздействия красного света на 10 Герц. Повторите эту процедуру три раза в общей сложности с последующим дополнительным 30-секундный интервал, где красный свет отсутствует. Сбор отдельных мух из каждой камеры на двуокиси углерода колодки.
Чтобы подвергать их повреждению антенны, аблат как левый, так и правый второй сегмент антенны. Это удаляет клеточные тела нейронов органа Джонстона в то время как аксональные проекции остаются в ЦНС. Восстановить мух в алюминиевых покрытых флаконов, содержащих 200 миллимолейра все транс-Retinal.
В соответствующих точках времени, например, семь дней после абляции антенны, подвергать мух другой уход анализа. В этом протоколе были представлены три метода для изучения морфологии и функции отрубленных аксонов и их синапсов. Первый метод позволяет высокое разрешение наблюдения отдельных аксонов в периферической нервной системе.
Схематические кресты для создания клонов дикого типа и хайвайра в крыле показаны здесь. Контроль в травмированных GFP помечены аксоны также представлены стрелы с указанием отрубленных аксонов. Представлен второй подход к изучению аксоновой смерти GFP с маркировкой сенсорных нейронных аксонов в головном мозге.
Схематические кресты для генерации диких и высокопроводных клонов в мозге показаны здесь. Примеры контроля в травмированных аксонов GFP представлены стрелками, указывающими на отрезанные аксоновы. Третий метод демонстрирует подход к визуализации аксональной и синаптической функции после аксотомии.
Схематические кресты для генерации дикого типа и dnmnat чрезмерного выражения органа Джонастона сенсорных нейронов показано здесь. Мухи дикого типа — мухи, содержащие органные нейроны Джонстона с затухаемой аксоновой смертью. Оба укрывал мощный уход поведение до травмы.
Тем не менее, семь дней после травмы, уход не удалось добиться от оптогенетики в диких мух типа, в то время как животные с затухаем аксон смерти продолжали жениха. Здесь мы используем потерю функциональных мутаций или наше выражение генов для наблюдения за сохранением аксональной морфологии или синаптической функции. Другие методы изменения могут быть применены, такие как сбить РНК-интерференции или ткани конкретных CRISPR-Cas9 опосредованного выбить выходы.
Эти методы могут быть использованы в травме независимого контекста. Они позволяют для наблюдения и характеристики факторов поддержания нейронов во время старения, аксонального транспорта, и аксональные органеллы в нетронутых аксонов.
