Микрофлюиды – это новый метод подготовки липосом размеров настраиваемых наночастиц и с большой воспроизводимостью и масштабируемостью. Этот протокол позволяет непрерывно высокой через выход производства низкой температуры чувствительных липосом для совместной загрузки с химиотерапевтических наркотиков, таких как доксорубицин и флуоресцентный краситель, таких как индоцианин зеленый. Препарат клеток в первую очередь использовать сверху вниз подход, такой как липидная пленка гидратации и экструзии.
Подготовка больших и воспроизводимых партий для клинического применения остается сложной задачей. Основным преимуществом микрофлюиды является способность обрабатывать небольшой объем жидкости с высокой управляемостью в пространстве и времени при непрерывной и автоматизированной работе. Демонстрация процедуры с Calvin Cheung будет Guanglong Ма и Амалия Руис, пост-докторант исследователей из моей лаборатории.
Для сборки шприц насосов используйте кабель сети насоса к насосу для подключения к компьютерному порту вторичного шприц-насоса к сетевому порту главного шприц-насоса. Используйте ПК для перекачки сетевого кабеля для подключения к компьютерному порту главного насоса к серийному порту RS-232 компьютера. Для сборки микрофлюидного устройства из стаггардной елочки micromixer используйте гайку и феррул для подключения труб к каждому из входов и розеток устройства.
Затем используйте второй гайку и феррулу и профсоюзную сборку, чтобы преобразовать терминал трубки для обоих входов в женский люэр. Чтобы настроить программное обеспечение для управления насосом, используйте кнопку установки шприц-насоса, чтобы назначить адрес главного шприца насоса и вторичного шприца насоса Ad:01 и Ad:02 соответственно, а затем открыть программное обеспечение управления насосом на компьютере. Два шприца насосы должны быть обнаружены автоматически следуют звуковой сигнал.
Выберите HSW Norm-Ject диаметром 5cc равен 12,45, чтобы присвоить диаметр 12,45 миллиметра. Установите скорость до 0,25 миллилитров в минуту для насоса один и 0,75 миллилитров в минуту для насоса два. Установите громкость до любого значения выше пяти миллилитров и выберите режим вливания для обоих насосов.
Затем нажмите набор, чтобы подтвердить настройки. Для подготовки LTSL10 или LTSL10 ICG липидной смеси, использовать один пять миллилитров люер блокировки шприц снять один миллилитр липидной смеси и еще пять миллилитров люэр замок шприц снять по крайней мере три миллилитров раствора сульфата аммония. Сдвиньте бочку фланг шприца к шприцу фиксатор насоса для установки загруженных шприцев на шприц насосы в вертикальном положении и прикрепить поршень фланг шприца к толкатель блок насоса и обернуть другой конец нагревательной ленты и температурный зонд с термостатом вокруг шприца, содержащего липидный раствор.
Оберните конец нагревательной ленты к шприцу, содержащем аковый раствор, соедините шприц, содержащий липидную смесь, с входом этанола и соедините шприц, содержащий раствор сульфата аммония, с аквеозным входом. Отрегулируйте положение поршеня, чтобы удалить пузырьки воздуха из шприцев по мере необходимости и подключите и отключите нагревательную ленту в 10 секундных интервалах, пока температура шприцев не достигнет около 51 градуса. Когда термостат показывает соответствующую температуру, нажмите запустить все в программном обеспечении управления насосом для запуска шприц насосов и проверить, что поток жидкости не имеет пузырьков воздуха и любой утечки.
Соберите липосомные образцы во флакон и приостановить или остановить вливание, когда любой шприц почти пуст. Аннеал собранные липосомные растворы в водяной бане 60 градусов по Цельсию в течение 1-1/2 часов перед передачей растворов для диализа труб для диализа против одного литра 240 миллимолярия сульфата аммония, по крайней мере четыре часа при 37 градусах Цельсия. Затем храните очищенные липосомы при четырех градусах по Цельсию.
Для удаленной загрузки липосом трансмембранного градиента рН загрузите 25 миллилитров HBS на верхнюю часть столбца хроматографии исключения размера и позвольте всем элюенту протекать через столбец. Загрузите один миллилитр диализаных липосом на столбец. Когда весь липидный раствор прошел через столбец, добавьте в столбец 1,5 миллилитров свежего HBS.
Когда весь буфер прошел через столбец, добавьте три миллилитров свежего HBS в столбец и соберите элуент. Далее добавьте раствор DOX в соотношении докса DOX:phospholipid molar к одному миллилитру липосомного раствора буферного обмена в бижуйский флакон и поместите флакон в водяную ванну 37 градусов по Цельсию в течение 1-1/2 часов. После загрузки очистить липосомы по размеру исключение хроматографии, как только что продемонстрировали.
Для лазерного нагрева индуцированного триггерного высвобождения липосомного содержимого установите водяную баню до 37 градусов по Цельсию. Когда температура стабилизируется, добавьте 200 микролитров DOX загруженных липосом к каждому колодец ясной пластины 96-колодец и поместите пластину в водяной бане с нижней погруженной в воду. Затем установите ток лазерной системы до 2,27 усилителя и поместите коллиматор лазерной системы на пять сантиметров вертикально над поверхностью пластины из 96 колодец.
Включите лазер и используйте зонд волоконно-оптической температуры для мониторинга температуры один раз в минуту. В пять и 10 минут, аспирировать 10 микролитров DOX загружены липосомы из каждой скважины ясно 96-хорошо пластины и добавить 190 микролитров HBS в трех отдельных скважин черный 96-хорошо пластины. Для оценки полного высвобождения препарата смешайте 10 микролитров липосом с 170 микролитров HBS и 20 микролитров 1%Triton X-100 моющего раствора в трех отдельных скважинах черной пластины 96 скважин.
Затем измерьте интенсивность флуоресценции DOX на считыватель пластин. Микрофлюидное производство LTSL4 приводит к гелеобразной вязкой раствор, иллюиллюторной большим количеством захваченных пузырьков воздуха, в то время как подготовка LTSL10 приводит к образованию ясной невязкой жидкости. Динамическое измерение рассеяния света LTSL10, подготовленное при 51 градусе по Цельсию, демонстрирует ожидаемый диаметр и дисперсию, указывающие на успех эксперимента.
Когда LTSL10 готовится при 20 градусах по Цельсию, однако, большие и более рассеянные липосомы получаются в результате неоптимального продукта. LTSLs подготовленные обычным методом гидратации липидной пленки с экструзией демонстрируют эффективность инкапсуляции DOX 50-80%С annealing, LTSL10 подготовленный microfluidics приводит к значительному увеличению эффективности инкапсуляции DOX до среднего 85%, что указывает на успех удаленной загрузки DOX и наличие трансмембранного pH градиента. Профиль выпуска DOX LTSL10 был определен как чувствительный к температуре.
LTSL10 имеет относительно широкий фазовой переход с наступлением на 41,6 градусов по Цельсию, что пики на 42,6 градусов по Цельсию. Эффективность загрузки МКГ зависит от первоначальной концентрации МКГ и размера и дисперсии образцов. Кроме того, LTSL10 ICG облучения с ближнего инфракрасного лазера вызывает фототермальное нагревание вызывает выпуск DOX.
При попытке этой процедуры, важно обеспечить стабильный поток жидкости так, что смешивание жидкости и, следовательно, образование липосом остаются воспроизводимыми. Липосомная аннеалирование и диализ являются двумя важными шагами для обеспечения стабильной липосомной формулировки с высокой грузоподъемности. Тестирование In vivo также может быть проведено для оценки биораспределеемости LTSL10, высвобождения наркотиков и противораковой активности.
Наш протокол может быть использован для успешного микрофлюидного производства без холестерина лизолипидсодержащих термочувствительных липосом для доставки лекарств.
