OLA — это универсальная микрофлюидная платформа, полезная для сообщества синтетической биологии. В частности, для биоинженерии искусственных клеток. Липосомы на основе OLA могут помочь нам понять принципы самоорганизации в биологии и построить сборки, имитирующие клетки.
OLA производит монодисперсные, однослойные липосомы размером с клетку с высокой пропускной способностью и с превосходной эффективностью инкапсуляции. Для этого требуются очень маленькие объемы образца, порядка 50 микролитров, и сформированные липосомы сразу же доступны для дальнейших экспериментов на чипе. OLA полезен для изучения биологических реакций в микроконфайнментах, динамики везикул и биомолекулярных конденсатов и их взаимодействия с мембранами.
OLA также применяется в качестве высокопроизводительной платформы для скрининга лекарств, например, для проверки проницаемости и мембранной активности противомикробных препаратов. Функционализация поверхности, которая представляет собой фотоэлектрическую обработку, является критическим шагом для протокола и должна быть тщательно выполнена, чтобы предотвратить попадание фотоэлектрического раствора во внутреннюю аквея и липидонесущие органические каналы. Кроме того, постпродакшн-канал должен быть достаточно длинным, чтобы отделение октанольных карманов образовывало липосомы.
Кетан Ганар, аспирант из моей лаборатории, поможет Чан Чену продемонстрировать процедуру. Для начала возьмите чистую кремниевую пластину диаметром четыре дюйма и очистите ее с помощью сжатого воздуха, чтобы удалить любые частицы пыли. Установите пластину на спин-коутер и аккуратно распределите около пяти миллилитров негативного фоторезиста в центре пластины.
Чтобы получить слой фоторезиста толщиной 10 микрометров, установите настройки спинового покрытия на 500 об/мин в течение 30 секунд с ускорением 100 RRP в секунду для начального разбрасывания, а затем 60-секундный отжим со скоростью 3 000 об/мин с ускорением 500 об/мин. Затем покройте. Выпекайте на нагревательной плите две минуты при температуре 65 градусов Цельсия, а затем пять минут при температуре 95 градусов Цельсия.
Как только пластина остынет, установите пластину в печатную камеру прямой правой оптической литографической машины и подайте в программное обеспечение липосомную сборку с октанолом или конструкцию OLA. После того, как дизайн будет напечатан, выпекайте при температуре 65 градусов Цельсия в течение одной минуты, а затем при температуре 95 градусов Цельсия в течение трех минут. Чтобы смыть неотвержденный фоторезист, опустите пластину в стеклянный стакан с раствором проявителя до тех пор, пока неотвержденный фоторезист не будет полностью удален.
Выпекайте пластину при температуре 150 градусов Цельсия в течение 30 минут, чтобы убедиться, что напечатанный дизайн надежно прикреплен к поверхности пластины и не отрывается в процессе последующего изготовления. Чтобы приготовить микрофлюидное устройство, поместите мастер-пластину на квадратный кусок алюминия и оберните алюминиевую фольгу вокруг пластины, образуя хорошо похожую структуру. Аккуратно вылейте смесь PDMS на мастер-.
Инкубируйте сборку в духовке при температуре 70 градусов Цельсия не менее двух часов. Достаньте из духовки и дайте ей остыть. Чтобы удалить затвердевший полидиметилсилоксан или блок PDMS, снимите алюминиевую фольгу, а затем осторожно снимите блок PDMS с края пластины.
Возьмите прозрачное стекло, налейте примерно 0,5 миллилитра PDMS на центр предметного стекла и распределите его по предметному стеклу, осторожно наклоняя предметное стекло, обеспечивая полное покрытие предметного стекла PDMS. Установите предметное стекло на отжимное покрытие. Убедитесь, что он расположен по центру так, чтобы середина суппорта перекрывалась центром напорного вала.
Затем вращайте предметное стекло со скоростью 500 об/мин в течение 15 секунд с шагом 100 об/мин и 1 000 об/мин в течение 30 секунд с шагом 500 об/мин. Поместите предметное стекло с покрытием PDM стороной с покрытием вверх на приподнятую платформу, как блок PDMS, в закрытой чашке Петри. Выпекайте его при температуре 70 градусов по Цельсию в течение двух часов.
Поместите блок PDMS с выгравированными каналами вверх, а предметное стекло с покрытием PDM стороной с покрытием вверх — в вакуумную камеру плазменного очистителя. Включите вакуум и подвергните содержимое воздействию воздушной плазмы на радиочастоте 12 мегагерц в течение 15 секунд, чтобы активировать поверхности. Кислородную плазму можно увидеть в виде розоватого оттенка.
Сразу после плазменной обработки поместите предметное стекло с покрытием PDMS на чистую поверхность стороной PDMS вверх. Аккуратно поместите блок PDMS так, чтобы микрофлюидный узор теперь был обращен к предметному стеклу с покрытием PDMS, чтобы они сцепились. Выпекайте склеенные устройства при температуре 70 градусов Цельсия в течение двух часов.
Налейте 200 микролитров 5%-ного поливинилового спирта или раствора OVA в 1,5-миллилитровую пробирку и подсоедините ее к подставке для микрофлюидного резервуара. Вставьте трубку таким образом, чтобы один конец был погружен в раствор ПВА, а другой конец был соединен с входным отверстием внешнего водного канала микрофлюидного устройства. Увеличьте давление внешней водной фазы до 100 миллибар, чтобы раствор ПВА протекал по наружным водным каналам.
Увеличьте давление внутренней водной и липидно-несущей органических фаз до 120 миллибар, чтобы предотвратить обратный поток раствора ПВА внутри этих каналов. Подайте раствор ПВА таким образом в течение примерно пяти минут, обеспечивая полную функционализацию выходного канала. Увеличьте давление в липидонесущих органических и внутренних водных каналах до двух бар, чтобы удалить раствор ПВА, и немедленно отсоедините трубку от внешнего водного входного отверстия.
Одновременно используйте трубку, соединенную с каналом отрицательного давления, для удаления излишков ПВС из выходного канала. Выпекайте устройство при температуре 120 градусов Цельсия в течение 15 минут и дайте ему остыть перед использованием. Устройство можно хранить в условиях окружающей среды не менее одного месяца.
Распределите растворы по трем 1,5-миллилитровым пробиркам и соберите их. Подключите их к микрофлюидному чипу, обработанному ПВА, и приложите положительное давление к трем каналам, около 100 миллибар на внутренние водные и липидонесущие органические каналы и около 200 миллибар на внешний водный канал. Как только все три фазы начнут сотечь на стыке, обеспечьте начало производства двойной эмульсии и отрегулируйте давление в соответствии с ее качеством.
По мере того, как капли двойной эмульсии текут, все карманы октанола становятся все более и более заметными и, наконец, отщипываются, образуя липосомы. Здесь показано ярко-польное изображение быстрого образования капель двойной эмульсии. Флуоресцентный липидный канал показывает образование октанольного полного кармана из-за частичного обезмачивания.
Внутренний водный канал показывает инкапсуляцию желтого флуоресцентного белка. На этом рисунке показано обезвоживание октанольного кармана в выходном канале, образующем липосому. На этом изображении представлена схема рН-зависимого перехода гомогенного раствора полилизина и АТФ, инкапсулированного в липосоме, в фазоразделенные полилизин АТФ коацерваты.
Исходная кислая среда в липосоме делает молекулярный заряд АТФ нейтральным, ингибируя коацервацию. Когда рН внутри липосом уравновешивается с наружным повышением рН, АТФ получает отрицательный заряд, вызывая коацервацию. На этом рисунке показано пространственное распределение полилизина и мембраны, а также покадровые изображения образования полилизиновых коацерватов АТФ в липосомах.
Внешняя версия базового буфера повышает уровень pH внутри липосом в течение нескольких минут и инициирует коацервацию. T равно нулю минут относится к времени непосредственно перед возникновением первого события коацервации. Во время демонстрации процедуры крайне важно терпеливо регулировать давление в канале, чтобы обеспечить стабильное производство двойной эмульсии.
OLA и его вариации использовались в различных исследованиях, например, в области роста и деления липосом, понимания динамики биомолекулярных конденсатов, бесклеточной экспрессии белка, а также инкапсуляции бактерий. Таким образом, мы считаем, что OLA является универсальной платформой для синтетической биологии.
