Используя этот протокол, миграция клеток и вторжение могут быть обнародованы в условиях реального времени, что позволяет клеточную кинетики в условиях потери или усиления функции гена и препаратов, которые будут определены. В отличие от других методов, не окрашивание, механические повреждения клеток, или флуоресцентные маркеры не требуется. Самое главное, в режиме реального времени клетки кинетики могут быть определены эффективным образом.
Когда U-118MG клеточной линии культуры достигает 70 до 80% слияния, мыть клетки с PBS перед лечением клеток с двумя миллилитров 0,5%трипсина-ЭДТА. Через 30 секунд при 37 градусах по Цельсию остановите реакцию с помощью 10 миллилитров свежей культуры среды и перенесите отдельные клетки в 15 миллилитровую коническую трубку. После подсчета, собирать клетки центрифугации и повторно гранулы в шесть раз от 10 до пятой клетки на состояние концентрации в соответствующем объеме свежей среды.
Передача шесть раз 10 к пятой клетки в одну трубку микроцентрифуг в состоянии и добавить 800 микролитров PBS Дульбекко в каждой трубке. После центрифугации, resuspend каждой гранулы в 60 микролитров повторного буфера R и шесть микромоляров siRNA интереса. Смешайте каждую трубку с нежным постукиванием перед электропостановки 10 микролитр aliquots каждой ячейки подвески с тремя 10-миллисекунды 1, 350 вольт импульсов.
После каждого лечения, бассейн электропотерированных клеток из каждого состояния в отдельных пяти миллилитров aliquots свежей среды культуры. Затем семя клетки в два 35 миллиметров культуры блюда в состоянии и поместить клетки в инкубатор культуры клеток в течение трех дней. За пять-шесть часов до анализа клеток в режиме реального времени поместите систему анализа клеток в инкубатор клеточной культуры в режиме реального времени.
Чтобы создать анализ вторжения, используйте обратную трубоуправляемую, чтобы поместить 50 микролитров DMEM, дополненных 0,1 микрограмма на миллилитр внеклеточного матричного геля в каждый колодец верхней камеры пластины вторжения клеток. Сразу же после покрытия удалите из каждой пластины 30 микролитров внеклеточного матричного раствора и поместите пластину в инкубатор клеточной культуры в течение четырех часов. Для того чтобы установить вверх программу измерения impedance, 6 часов перед измерением, замените средство в всех electroporated культурах клетки с низкой средой сыворотки.
В соответствии с вкладкой Layout в связанном с этим программном обеспечении измерения неустумности выберите четырехкратные скважины для каждого биологического состояния. В соответствии с вкладкой Расписание установите одно время базового шага измерения с интервалом в одну минуту и установите второй шаг для измерения импульса ячейки в соответствующих отдельных колыбелях для фактического эксперимента. За час до начала измерения клетки в скважины нижней палаты клеточной нашествия и миграционной пластины добавить 160 микролитров среднего уровня, дополненных 10%-фетальной сывороткой крупного рогатого скота в качестве химиоаттраканта.
Для измерения вторжения соберите верхнюю камеру, содержащую внеклеточный матричный гель с покрытием колодцев. Для измерения миграции используйте неокрашенные скважины в верхней палате. Для любого типа эксперимента заполните скважины в верхней камере 50 микролитров низкой сывороточной среды и поместите камеры в колыбель системы.
Нажмите на вкладку Сообщение в программном обеспечении, чтобы определить, признаются ли все скважины блоком управления. Если сообщение отображается, как ожидалось, пластина в колыбели готова к эксперименту. Затем поместите полностью упакованные пластины в инкубатор клеточной культуры в колыбели системы анализа клеток в режиме реального времени в течение одного часа, чтобы акклиматизировать пластину к условиям клеточной культуры.
В то время как пластины уравновешены, урожай клеток глиобластомы, как попродемонстрировано, и resuspend клетки от каждого состояния в восемь раз от 10 до пятой клетки на 800 микролитров низкой средней концентрации сыворотки. Кроме того, отложите три раза от 10 до пятой клетки в двух миллилитров среды культуры для посева в 35 миллиметров блюдо для вниз по течению Западной помарки анализа. Для измерения базового предмиммитного чтения в конце акклиматизации нажмите кнопку «Начало колыбели».
После того, как базовые измерения были приобретены, перенесите миграцию и нашествие пластин из их соответствующих колыбелей в шкаф биобезопасности. Обратная пипетка 100 микролитров клеток в четырехкратные верхние камеры скважин для каждого биологического состояния в соответствующем колодце вторжения клеток и миграционных пластин, как запрограммировано в блоке управления колыбели. После посева, держать пластины в шкафе биобезопасности в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы клетки равномерно поселиться на дне пластины, прежде чем передавать пластины их соответствующих колыбели.
Нажмите кнопку "Начало колыбели", чтобы начать измерение импульса клетки. Чтобы визуализировать изменения в ячейке в качестве клеточного индекса в зависимости от времени во время или после завершения эксперимента, откройте вкладку анализа данных. Чтобы визуализировать данные по каждому из соответствующих условий по отдельности или в качестве средних и/или стандартных отклонений, нажмите на коробки опций для среднего и стандартного отклонения.
Чтобы экспортировать данные индекса ячейки в файл электронной таблицы, поместите курсор в середину окна анализа данных и нажмите правой кнопкой мыши. В поле диалога, которое появляется, выберите данные копирования в вариант формата списка и вставьте данные в открытую таблицу. Чтобы выпустить эксперимент, нажмите кнопку выпуска в каждой колыбели.
Crk адаптер белка нокдаун снижает Crk1 и Crk2 уровни белка на 85% и 86% соответственно, не вызывая Crk-как уровень белка. Нокдаун Crk-как уменьшает Crk-как выражение протеина 85%с небольшим уменьшением в уровнях протеина Crk1 и Crk2. Объединение обоих siRNAs уменьшает Crk1, Crk2 и Crk-подобное выражение более чем на 80%, в то время как ни винкулин, ни альфа-тубулин выражение зависит от какой-либо комбинации Crk или Crk-как нокдаун.
Клетки глиобластомы головного мозга человека мигрируют вдоль градиента в ответ на высокие концентрации сыворотки, достигая максимального уровня миграции в 13 часов. В crk нокдаун ячейки, хотя миграция первоначально задерживается, клетки продолжали мигрировать до 23 часов. Crk-как нокдаун существенно снижает миграцию клеток с линией клеток глиобластомы полностью теряют свою миграционную способность после нокдауна как Crk и Crk-как предполагая, что Crk и Crk-как играть существенные перекрывающиеся роли в миграции раковых клеток.
Однако, когда вторжение клеток контролируется в течение нескольких дней, Crk нокдаун клетки достигают аналогичного максимального уровня вторжения клеток по сравнению с контролем клеток глиобластомы на 60 часов с Crk-подобных клеток частично восстановления их инвазивной способности на 90 часов и двойной Crk-Crk клетки демонстрируют снижение способности вторгаться после 40 часов. Результаты явно поддерживают предположение о том, что вторжение клеток должно быть проанализировано в течение всего периода эксперимента. Посев нужное количество клеток и избежать пузырьков воздуха при записи внеклеточной матрицы для вторжения анализа и посева клеток являются ключевыми моментами для успеха этого эксперимента.
После аналогичной процедуры, но с помощью электронных пластин, клеточной адгезии и кинетики пролиферации клеток может быть определена.
