Наш протокол оценивает влияние миелоидных клеток супрессоров и связанных с опухолью макрофагов при апоптозе опухолевых клеток, вызванных Т-клетками. Наряду с исследованием основных механизмов потенциальных терапевтических вмешательств. Этот протокол непосредственно оценивает Апоптоз опухолевых клеток, вызванных Т-клеток, с высокой чувствительностью и позволяет продольный анализ и визуализацию взаимодействий между клетками и клетками.
Эффективность ингибитора контрольно-пропускных точки лучше всего рассматривать опухолевым проникновением миелоидных клеток в определенных типах опухолей. Этот метод может привести к выявлению новых методов лечения этих опухолей. Этот метод может не только продвинуть исследования иммунологии рака, но потенциально может также обеспечить понимание иммунодефицита и аутоиммунных заболеваний.
Для активации и расширения селезенки изолированных CD8-положительных Т-клеток, первый aliquot один раз от 10 до пятого CD8-положительных Т-клеток в 50 микролитров E-DMEM в отдельных скважин 96-ну U-нижней пластины. Затем добавьте один раз 10 к пятой клетке супрессора в 50 микролитров E-DMEM, или 50 микролитров E-DMEM в одиночку, в каждый колодец Т-клеток. Затем добавьте 50 микролитров свежеприготовленной среды активации и 50 микролитров E-DMEM, с или без представляющих интерес испытательных реагентов, к соответствующим скважинам.
И поместите пластину в 37-градусный по Цельсию и 5%углекислый газ инкубатор с 95% влажности в течение четырех дней. Чтобы создать предварительно активированный CD8-положительный Т-клеток целевой ячейки совместно культуры, сначала добавить 30 микролитров от 1 до 100 разбавленных роста-фактор-уменьшенный растворимый мембраны мембраны мембраны скважины 96-ну плоский дно пластины, подходит для микроскопии. Встряхните пластину, чтобы равномерно распределить матрицу, и поместите пластину в инкубатор клеточной культуры, по крайней мере один час.
Пока пластина уравновешена, подготовь клетки-мишени. Аспирировать средний, мыть с PBS, и добавить один миллилитр 05%Трипсин-ЭДТА при комнатной температуре в течение одной минуты. Добавьте девять миллилитров DMEM, дополненных сывороткой крупного рогатого скота плода, нежной трубой, и перенесите диссоциированные клетки в трубки.
После центрифугирования клеток, повторно помыть поддон в 500 микролитров E-DMEM. Фильтр повторного перерасхода клеток через ситечко клетки, и рассчитывать живые клетки. Затем отрегулируйте плотность в четыре раза 10 до четвертой целевой ячейки на миллилитр в свежем E-DMEM на льду.
Далее, пипетка предварительно активированных CD8-положительных Т-клеток несколько раз, чтобы повторно использовать клетки в одной клеточной подвески, и передачи плавающих Т-клеток в один 1,5-миллилитровую трубку в состоянии. Соберите все оставшиеся клетки с 200 микролитров PBS на колодец, перенесите моет в соответствующие 1,5-миллилитровые трубки и центрифугу. Аспирировать среду и добавить один миллилитр E-DMEM к каждой трубке для центрифугации.
После центрифугации, повторное производство гранул в 100 микролитров свежих E-DMEM на трубку. После подсчета, настроить клетки в каждой трубке с плотностью 1,6 раза 10 до пятого предварительно активированного CD8-положительных Т-клеток на миллилитр среды, и место клеток на льду. Когда клетки будут готовы, аспирировать мембранную матрицу подвала из каждой скважины 96-хорошо микроскопии пластины, и добавить 50 микролитров целевых клеток в отдельных скважин во внутренних 60 скважин пластины с смешиванием.
Добавьте 25 микролитров E-DMEM, дополненных четырьмя 10 раз на третью единицу на миллилитр IL2, и 10-микромолейный фторгенный субстрат-3 к соответствующим скважинам. Затем добавьте 25 микролитров предварительно активированных CD8-положительных Т-клеток в соответствующие скважины. И, наконец, добавить E-DMEM к соответствующим скважинам, чтобы сделать общий объем до 100 микролитров.
Добавьте 200 микролитров PBS или стерильной воды во все пустые колодцы. Встряхните тарелку и оставьте тарелку на ровной поверхности на 10 минут. Для изображения клеток установите микроскоп для получения изображений в фазовом контрасте.
А также флуоресцентные каналы, пригодные для ядерно-ограниченного флуоресцентного белка, а также флюорогенные активированные флуорофоры, активированные казпазы-3, используемые в эксперименте. Затем захватывать изображения каждой экспериментальной хорошо в фазовом контрасте и два канала флуоресценции каждые один-три часа, по крайней мере 72 часов. Для анализа захваченных изображений откройте изображение из контрольного хорошо содержащего только клетки-мишени и средние без подложки caspase-3 в канале флуоресценции, используемом для сигнала субстрата.
Обратите время на то, излучается ли ядрам неуместный сигнал флуоресценции. Если сигнал субстрата очевиден в ядрах, используйте спектральное несмешие, чтобы увеличить процент сигнала субстрата, удаленного из сигнала ядер, до тех пор, пока сигнал субстрата не исчезнет. Далее, просмотреть контроль хорошо содержащие только ядра неоцеличные клетки эффектора в среде без каспазы-3 субстрата в двух каналах флуоресценции индивидуально.
Следите за тем, излучается ли сигнал ядрами. Если в отдельных каналах нет сигнала, не требуется спектральное несмешие. Для разрешения флуоресцентных объектов в обоих каналах флуоресценции используйте метод вычитания фона флуоресценции с соответствующими параметрами для образца и соответствующими параметрами для расщепления края.
Используйте изображения монокультуры целевых клеток для установления параметров ядерной флуоресценции клеток-мишеней. Используйте изображения монокультуры клеток-эффекторов для установления параметров субстрат-индуцированной апоптотической ядерной флуоресценции. Используйте изображения совместной культуры для проверки или уточнения параметров субстрат-индуцированной апоптотической ядерной флуоресценции в клетках-мишенях.
Для определения минимального размера ядер-мишеней используйте изображения в сигнальных каналах ядер из скважин, содержащих только клетки-мишени с подложком каспаса. Для определения среднего размера ядра апоптотического эффектора используйте изображения в канале сигнала субстрата из скважин, содержащих только клетки-эффекторы с подложком каспаса. Чтобы подсчитать количество ядер клеток-мишеней флуоресценции, найте процедуру анализа с использованием соответствующего минимального ограничения размера.
Используя монокультурные изображения клеток-эффекторов, найте вторую процедуру анализа для подсчета количества апоптотических ядер, которые больше среднего размера ядер апоптотических эффекторов. Затем была создана третья процедура анализа для подсчета количества апоптотических целевых ячеек путем подсчета количества ядер, в которых сигнал ядра и сигнал с ограниченным размером субстрата значительно ко локализуются. Как правило, раковые клетки увеличивают сигнал флуоресценции в своих ядрах после активации биосенсора каспазы, когда клетки впадают в контакт с CD8-положительными Т-клетками, предварительно активированными антителами при отсутствии супрессорных клеток.
Размеры ядра CD8-положительных Т-клеток меньше, чем у раковых клеток. Таким образом, апоптотические клетки-эффекторы могут быть исключены из апоптотических целевых клеток с помощью метода анализа изображений ограничения размера. Хотя некоторые целевые раковые клетки обладают небольшой округлой формой без субстратной флуоресценции, это не влияет на анализ.
Поскольку эти клетки претерпевают митоз, а не апоптоз и, таким образом, исключаются из апоптотических клеток-мишеней с помощью маски перекрытия ядерного субстрата. Со-культура целевых раковых клеток с предварительно активированными CD8-положительными Т-клетками увеличивает апоптоз опухолевых клеток выше уровня спонтанного апоптоза в монокультурах раковых клеток. Как правило, при использовании оптимального соотношения целевых раковых клеток к клеткам-эффекторам можно наблюдать пик числа апоптотических целевых раковых клеток.
Этот пик становится более отчетливым, когда данные выражаются как апоптотическая доля целевой популяции клеток. Самое главное помнить при попытке этого протокола является настройка монокультур целевых клеток и монокультур клеток-эффекторов для использования в разработке аналитических масок. Этот метод может дать представление о продолжительности и частоте взаимодействия Т-клеток с раковыми клетками, а также об условиях, связанных с генозависимыми цитотоксичностью как в клетках человека, так и в клетках мыши.
В настоящее время мы разрабатываем этот анализ в высокой пропускной способности экрана с использованием человеческих клеток для выявления соединений, которые подавляют миелоидных клеток опосредовано иммуносупрессии и тем самым повысить эффективность ингибитора контрольно-пропускного пункта.
