Мобильность раковых клеток имеет решающее значение для начала метастазирования. Поэтому исследование движения клеток и инвазивной способности опухолевых клеток представляет большой интерес. Этот комплексный метод для исследования миграции раковых клеток и вторжения, на одной платформе в режиме реального времени, обеспечивает легко воспроизводимый и эффективный во времени вариант для изучения подвижности клеток и патологии.
Этот метод может дать представление о вторжении раковых клеток, через внеклеточную матрицу, и может быть применен к другим типам клеток. Для достижения оптимального времени нуля убедитесь, что плотность посева была оптимизирована и не продлевайте инкубационный период после того, как монослой клетки достигнет 100-процентного слияния. Чтобы определить оптимальное количество семенных клеток для анализа миграции, поместите клетки в диапазон плотности в три раза в 96-стенной пластине.
Поместите пластину в живой образец ячейки и выберите сканирование расписания из списка задач в программном обеспечении imager. В панели установки ящика, определить положение пластины, и нажмите добавить vessel'to выбрать тип пластины. В панели настройки сканирования выберите или отредактировать шаблон сканирования в соответствии с экспериментальной установкой пластины и установите тип сканирования в качестве стандарта.
Нажмите правой кнопкой мыши на временной шкале и выберите установленные интервалы. Затем установите добавить сканирование каждые два часа в течение 24 часов, и нажмите применить. Через 24 часа откройте установку ящика, чтобы экспериментальная пластина была выбрана, и нажмите кнопку удалить сосуд.
Выберите три-шесть репрезентативных изображений и поместите их в новую коллекцию изображений. Чтобы определить правильное определение обработки, используйте регулировку сегментации, очистку и фильтры для применения соответствующей маски слияния и используйте предварительный просмотр тока all'to для просмотра точности масок. Запустите анализ работы и определить оптимизированную плотность клеток, в соответствии с приблизительной 100-процентное слияние со временем, в течение шести-восемнадцати часов, в зависимости от того, когда миграционный анализ начинается.
Затем примените инструмент анализа обработки слияния к изображениям контрастности фазы высокой четкости, автоматически собранным для генерации кривой пролиферации ячейки со временем. Перед началом анализа, пальто пластины для анализа вторжения с 50 микролитров внеклеточного матричного геля, разбавленного в ледяной среде культуры клеток, до 100 микрограмм на миллилитр концентрации. Затем поместите тарелку в инкубатор клеточной культуры на ночь.
На следующий день, осторожно аспирировать избыток среды, и пластины клеток при оптимизированной плотности, в тройном, в соответствующие скважины внеклеточной матричной пластины, и в дополнительной неокрашенной пластины 96-хорошо. Затем поместите пластины в инкубатор клеточной культуры на ночь. На следующее утро поместите неокрашенную миграционную анализированную пластину в держатель базовой пластины скретч-инструмента и используйте направляющие дюбели, чтобы аккуратно поместить верхнюю часть держателя на основание.
Нажмите и удерживайте черный рычаг, тщательно поднимая контактный блок, чтобы сделать царапины. Царапины в каждом колодеце должны быть видны невооруженным глазом, а также под микроскопом. Затем, мыть пластину один или два раза с предварительно разогретой среде культуры, чтобы удалить любые отдельные клетки или листы клеток.
Для анализа вторжения, поцарапать покрытием пластины, как только что продемонстрировали. После удаления любых отдельных клеток и листов, используйте предварительно охлажденный прохладной коробке для равновесия пластины на четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут, прежде чем тщательно аспирации холодной среде. Затем добавьте 50 микролитров разбавленного внеклеточного матричного геля в соответствующие скважины и поместите пластину в инкубатор клеточной культуры в течение тридцати минут.
Пузыри являются общими при работе с внеклеточной матрицы гель, но они могут быть устранены путем аспирации 70 процентов этанола. Затем добавьте 100 микролитров свежей, теплой среды, с или без испытательного соединения, в соответствующие скважины либо миграции или вторжения анализ пластины, и поместите пластину в живой платформы изображения клеток. Для очистки нуля инструмент, поместите верхний контактный блок в отдельных 45 миллилитров мыть лодки, содержащие 5 процентов моющего средства один, один процент моющего средства два, стерильные дистиллированной воды, или 70 процентов этанола в течение пяти минут за стирку перед размещением нуля инструмент обратно на свою базовую тарелку, для хранения в без пыли окружающей среды.
Для визуализации раны анализы, после того, как пластина equilibrate в течение пяти минут, выберите сосуд type'as плоскости журнала изображений, и установить тип сканирования, как царапина раны. Выберите или отредактировать шаблон сканирования, в соответствии с экспериментальной установкой пластины, и запланировать 24 часов повторного сканирования каждые один-два часа в течение 72 часов, или до тех пор, пока раны заживают, как попродемонстрировано. Когда все раны заживут, прекратите сканирование и выберите три-шесть репрезентативных изображений, охватывающих диапазон звуковых процентов, включая изображения сразу после того, как рана была сделана, и закрытие раны на 10 и 50 процентов.
Чтобы определить правильное определение обработки, примените соответствующую маску для скретч-раны и маску для слияния, как это было продемонстрировано, и используйте предварительный ток all'to для просмотра точности масок. Затем запустите работу по анализу. В миграционном анализе ширина раны — это среднее расстояние между листами клеток рядом с раной.
Слияние ран – это слияние в районе раненых. Идеальное начальное слияние ран должно быть близко к нулю процентов. Относительная плотность ран и слияние ран свидетельствуют о скорости клеток, занимающих область царапинной раны.
Эти данные почти пересекаются в обеих этих репрезентативных клеточных линиях. Различные клеточные линии демонстрируют очень разные способности заживления ран, что указывает на дифференциальные миграционные способности между клеточными линиями. Например, ламеллиподия наблюдается в этой линии клетки аденокарциномы молочной железы на миграционном фронте в начале миграции, в то время как эта муцин 1-продукция линии раковых клеток молочной железы не проявлял никаких признаков миграции клеток в то же время.
Кроме того, относительная плотность раны линии аденокарциномы молочной железы была насыщена через 50 часов, в то время как относительная плотность раны слизистой оболочки 1-продукуютой линии раковых клеток молочной железы не менялась с течением времени, подчеркивая высокоинвазивный фенотип клеток аденокарциномы и неинвазивность муцина 1-продукющих раковых клеток молочной железы. Клетки аденокарциномы также вели себя по-разному, вторгаясь через внеклеточный матричный гель, демонстрируя удлиненную морфологию с ведущими выступами, а в миграционных анализах был визуализирован порок на миграционном фронте. При обливлении, помните, что если слишком мало клеток посеяны, царапина не будет образовываться должным образом, и если слишком много клеток посеяны, не будет переполненности.
После этой процедуры, трек лечения могут быть добавлены, что позволяет этот метод, который будет адаптирован для высокой пропускной способности трек скрининга. Этот метод позволяет исследователям выполнять эти анализы на одной платформе, которая имеет высокую пропускную способность, и позволяет исследователям контролировать свои клетки в режиме реального времени, а не в экспериментальной конечной точке. Дезинфицирующие средства, используемые для стерилизации нуля инструмент может быть опасным.
Убедитесь, что вы собираете и распоряжаетесь решениями в соответствии с соответствующими MSDS, а также регулярными триггерными линиями вашего объекта.
