Наш протокол совместим с другими методами молекулярного анализа и позволяет оценить, как препараты влияют на жизнеспособность срезов тканей и производительность среднего пропускного отбора. Основным преимуществом этого метода является то, что мы можем измерить жизнеспособность всего ломтика ткани в режиме реального времени с очень небольшим до или после обработки. Этот метод ускоряет доклиническую разработку лекарственных препаратов и онкологию путем тестирования кандидатов на наркотики или ломтиков тканей, полученных непосредственно из образцов опухолевых тканей пациента.
Наш метод оценки жизнеспособности тканей в реальном времени является достаточно универсальным и может быть применен к биологии рака, неврологии и исследованиям биологии развития. Подготовка в такт жизнеспособных ломтиков тканей является ключом к успеху процедуры. Настройки vibratome в среднем составе должны быть скорректированы в зависимости от типа ткани и у твердости.
В день приобретения ломтика опухолевой ткани, aliquot 250 микролитров ткани ломтик культуры среды на колодец в 24 хорошо пластины и место одной культуры ткани вставить в каждый колодец. Затем поместите пластину в 37 градусов по Цельсию увлажненной инкубатор с пятью процентами углекислого газа до использования. Чтобы приобрести фрагменты опухолевых тканей, погрузите опухолевую ткань в ледяную HBSS в 10-сантиметровую культурную пластину и используйте скальпель, чтобы разрезать ткань пополам.
Используйте шестимиллиметровый пунш биопсии, чтобы приобрести цилиндры опухолевой ткани и обрезать один конец каждого цилиндра, чтобы создать плоскую поверхность. Поместите кусочки ткани в свежий, ледяной HBSS и включите vibratome. Дезинфицировать все оборудование с семидесяти процентов этанола и место Vibratome буфер лоток, покрытый акриловой стеклянной крышкой, в центре ледяной ванны Vibratome.
Добавьте лед в ванну, заполните буферный лоток холодным HBSS. Загрузите лезвие бритвы в держатель лезвия и используйте зубчатые типсы, чтобы тщательно выбрать биопсию пробчатой опухоли. Добавьте каплю клея цианоакрилата медицинского класса на пластину образца.
Dab ткани на кусок без ворса бумажное полотенце, чтобы удалить излишки буфера и смонтировать цилиндр ткани на падение в вертикальном стабильном положении. После двух-трех минут высыхания воздуха поместите пластину в буферный лоток и добавьте дополнительные HBSS в лоток, пока ткань полностью не будет погружена в буфер. Затем соберите Vibratome, поместив лоток со льдом и буферный лоток сборки на Vibratome и блокировки руку.
Установите толщину резки Vibratome до 250 микрометров, амплитуду до трех миллиметров, скорость нарезки до 0,01-0,25 миллиметра в секунду и угол лезвия до 15-21 градуса. Установите стартовые и конечные локации лезвия и отрегулируйте высоту сцены. Запустите инструмент в непрерывном режиме, чтобы сократить ломтики в течение нескольких циклов, пока ткани не будут сокращены равномерно.
Используйте широкий отзыв передачи двуногих для передачи ломтиков и небольшое количество HBSS в отдельных вставки культуры клеток в каждом колодца из ранее подготовленных 24 хорошо пластины и использовать штраф отзыв передачи двуногих удалить излишки буфера из скважин. Когда конец образца был достигнут, смонтировать новый кусок ткани и получить дополнительные ломтики, пока достаточно образцов были приобретены. Затем культура ткани ломтиками в инкубаторе клеточной культуры в течение 24 до 48 часов.
Для измерения жизнеспособности ломтиков ткани, подготовить люминесценции основе жизнеспособности измерения реагент, содержащий как люцифераза и prosubstrate на один до одной тысячи разбавления в свежей ткани ломтик культуры среды в соответствии с инструкциями производителя и заменить средний в каждом хорошо 24 хорошо пластины со смесью. Добавьте 50 микролитров ферментной субстратной смеси на каждый кусочек ткани и поместите пластину на орбитальный шейкер внутри увлажненной инкубатора с нежным возбуждением при 37 градусах По Цельсию и пятипроцентным углекислым газом за одну ночь. На следующее утро измерьте сигнал люминесценции в каждой пластине на считыватель микроплюсов, используя соответствующие настройки.
После определения базовой жизнеспособности ломтиков ткани, растворить препараты, представляющие интерес в среде культуры ломтик ткани, чтобы получить 10x фондовых решений и добавить каждый 10x раствор препарата в культуре среды в нижней части каждой ткани ломтик хорошо. Передача 50 микролитров препарата дополняется среды от нижней части каждой хорошо на каждый срез ткани и вернуть ломтики на орбитальный шейкер на ночь. На следующее утро перенесите культурную пластину в субкультурный инкубатор без встряхивания и измерьте люминесцентную интенсивность в каждом образце ткани на считывании микропластичек в соответствующих экспериментальных точках времени.
Жизнеспособность обработанных опухолевых тканей в каждый момент времени может быть рассчитана с помощью уравнения, как указано. Жизнеспособность ломтиков тканей, подготовленных из образца опухоли рака молочной железы мыши, может сохраняться в течение по крайней мере 21 дней с редкими средними обменами. Лечение ингибитором мультикиназы в течение четырех дней снижает интенсивность сигнала люминесценции в 100 раз по сравнению с контрольными опухолевыми тканями, обработанными диметиловым сульфоксидом.
Лечение с половиной концентрации одного и того же ингибитора уменьшает люминесценцию уже в первый день и достигает самого низкого уровня в четвертый день, оставаясь низким для каждой последующей измеренной точки времени. В отличие от этого, люминесцентная интенсивность контролируемой группы опухолевых тканей остается стабильной на протяжении шестидневной культуры. Кроме того, лечение мышей рака молочной железы опухоли ломтиками с серийными дозами ингибитора в течение четырех дней иллюстрирует доза-зависимых изменений в жизнеспособности ломтика в половине максимальной эффективной концентрации препарата.
Пациент производных ксенотрансплантатов лечение доксорубицином, стандартный химиотерапевтический препарат, также проявляют дозозависимые изменения в жизнеспособности. Кроме того, тестирование семнадцати доклинических и клинически одобренных препаратов в трилировании на ломтиках тканей, подготовленных из одного массового ксенотрансплантата пациента, является доказательством концепции того, что скрининг на наркотики средней пропускной способности может проводиться на ломтиках опухоли с микросредую опухоли. При подготовке образцов опухолевых тканей, заботиться, чтобы свести к минимуму контакт с ломтиками тканей, чтобы избежать повреждения тканей.
Наш метод может быть соединен с другими подходами, такими как IHC, цитометрия потока, или одноклеточное секвенирование, для получения пространственной и одноклеточной информации из тканей. Наша методика позволяет со временем тестировать эффекты нескольких препаратов, представляющих интерес в различных дозах в физиологических условиях. При подготовке ломтиков тканей от опухолей с неизвестным патогенным статусом обязательно выполняем все процедуры в кабинете биобезопасности.
