Наш протокол позволяет нам надежно количественно микробных хемотаксис непосредственно в их родной среде обитания. Таким образом, мы можем изолировать микроорганизмы, и мы можем лучше количественно оценить и понять метаболический потенциал. Анализ химиотерапии in situ, или ISCA, короче говоря, является гибким, удобным и простым устройством, которое позволяет новое понимание микробного поведения и, следовательно, роль и функцию микроорганизмов в любой среде, которая имеет жидкую фазу.
Демонстрация процедуры развертывания как в лаборатории, так и на местах является Эстель Клерк, которая в настоящее время является аспирантом в моей исследовательской группе. Перед приготовлением хемоаттраканта процедить носитель с помощью фильтра 0,2 микрометра и автоклав отфильтрованного раствора. Затем приготовьте 10 миллимолярный раствор хемоаттраканта в 1 миллилитре стерильной среды и отфильтрувте раствор химиоаттраканта с помощью фильтра шприца 0,2 микрометра для удаления любых частиц и потенциальных загрязняющих веществ.
Затем разбавьте отфильтрованный раствор химиоаттраканта в серии, согласно экспериментальному протоколу. Чтобы заполнить ISCA, прикрепите 27 калибровочных игл к 1 миллилитровому шприцу и загрузите один шприц для каждой концентрации фильтрованного химиоаттраканта. Удерживая устройство с видом на порт вверх, медленно впрыскивает каждую концентрацию вещества в каждую из пяти скважин одного ряда устройства до тех пор, пока на каждом порту не появится небольшая капля.
Когда все скважины были заполнены, передача 1,5 миллилитров морских или пресноводных бактерий культуры, представляющие интерес в 150 миллилитров соответствующей бактериальной среды культуры. Затем поместите два небольших кусочка двусторонний клейкой лентой на плоскую поверхность лотка емкостью 200 миллилитров. И закрету один ISCA на каждом куске ленты.
Используя серологическую пипетку 50 миллилитров, медленно заполняйте лоток развертывания бактериальным раствором. И позволить бактериям реагировать на химиоатрактант интереса в течение одного часа. Чтобы закончить анализ, используйте новый 50 миллилитров пипетки, чтобы аккуратно удалить среду из лотка ISCA.
Чтобы получить образцы, сначала распоять ISCA так, чтобы порт высовыйся вниз. Затем используйте стерильный 1 миллилитровый шприц, оснащенный иглой 27 калибра, чтобы извлечь раствор из каждой хорошо. Вытягивание образцов из каждого ряда одинаковой концентрации в одну трубку.
Затем проанализируйте образцы по цитометрии потока, чтобы определить количество бактерий, привлеченных к каждой концентрации химиоаттраканта. Чтобы подготовить ISCA к развертыванию на местах, во-первых, собрать 5 миллилитров воды на ISCA со стороны поля и фильтровать воду через фильтр шприца 0,2 микрометра в 50 миллилитров конической трубки. Пройдите шприц фильтрованной воды через гидрофильные GP фильтр картридж два раза, собирая фильтр в новой 50 миллилитров конической центрифуги трубки, после каждого полоскания.
Затем фильтруй воду через фильтр шприца 0,02 микрометра в новую 50-миллилитровую трубку. Используйте алициты фильтрата, чтобы повторно использовать все хемоаттрацанты, представляющие интерес для желаемых концентраций в отдельных 15 миллилитров конических труб. Затем используйте 10 миллилитровых шприцев для фильтрации повторного использования химиоаттрацантов через отдельные 0,2-метровые шприц-фильтры в стерильные 15 миллилитровых конических центрифугных трубок для удаления нежелательных частиц или водорастворимых соединений.
Для развертывания ISCA на местах, винт каждого ISCA на кусок 9 корпуса устройства и закрыть корпус. Печать корпуса с клейкой лентой и использовать банджи шнуры для обеспечения корпуса для развертывания руку и человека сделал структуры. Кроме того, корпус может быть закреплен с небольшим весом на мелком субстрате или прикреплен к сети в Пелагском океане.
Погрузите корпус полностью, чтобы начать заполнение, держа корпус твердо, чтобы предотвратить чрезмерное движение воды внутри. После того, как уровень воды достиг верхней части корпуса, убедитесь, что нет воздуха в ловушке внутри. Когда корпус полностью заполнен, запечатать нижнее и верхнее отверстия с двумя пробками.
Затем оставьте ISCA на месте на 1-3 часа. В конце периода отбора проб удалите вольер из воды. Поместите корпус над контейнером, чтобы слить воду, и тщательно удалить верхнюю часть клейкой ленты из передних отверстий.
После того, как линия воды прошла ниже верхней части ISCA, удалить нижнюю вилку и процедить остальную часть воды. В то время как ISCA по-прежнему прикреплены к корпусу, используйте 1 миллилитр пипетку, или 1 миллилитр шприц, чтобы тщательно удалить воду, захваченную поверх каждого ISCA и удалить ISCA, не касаясь верхней поверхности. Затем используйте одноразовую салфетку, чтобы удалить оставшуюся жидкость на поверхности, и получить образцы, как попродемонстрировано для лабораторного поиска образца.
В этом репрезентативном анализе in vitro, 1 миллимоляр был определен как оптимальная концентрация развертывания глутамина, поскольку он вызвал значительный химиотатический ответ, который был в 18 раз выше, чем фильтрованный контроль морской воды. Более высокие и более низкие концентрации глутамина также вызвали значительную, но более слабую, химиотаксическую реакцию. В ходе этого анализа развертывания на местах пять репликаций ISCA, наполненных 1 миллимоляном глутамина, были развернуты в течение 1 часа на прибрежном участке недалеко от Сиднея, Австралия.
А глутамин, заполненный ISCA, привлек почти в три раза больше бактерий, чем контрольные скважины, заполненные фильтрованной морской водой. Самое главное помнить при развертывании ISCA, как в лаборатории, так и в полевых условиях, чтобы избежать создания сильных потоков жидкости, которые будут препятствовать хемотаксис. Полученные ISCA образцы могут быть использованы для выявления конкретных организмов или генов, для характеристики геномного потенциала химиотатических организмов, а также для целенаправленной изоляции конкретных штаммов на селективных средствах массовой информации.
