私たちのプロトコルは、私たちが自宅の生息地で直接微生物の走気軸を堅牢に定量することを可能にします。そして、それによって微生物を分離することができ、代謝の可能性をよりよく定量化し、理解することができます。in situ chemotaxisアッセイ、つまりISCAは、微生物の挙動に関する新しい洞察を可能にする柔軟で使いやすいシンプルなデバイスであり、液体相を有するあらゆる環境における微生物の役割と機能を可能にします。
研究室と現場の両方で展開する手順を実証しているのは、現在私の研究グループの博士課程の学生であるエステル・クレールです。化学誘引剤を調製する前に、0.2マイクロメートルのフィルターで培地を濾過し、フィルターした溶液をオートクレーブします。次に、1ミリリットルの滅菌培地で10ミリモルの化学誘引剤溶液を調製し、0.2マイクロメートルの注射器フィルターで化学誘引剤溶液を濾過し、粒子および潜在的な汚染物質を除去する。
次いで、実験プロトコルに従って、フィルター処理された化学誘引薬ストック溶液を直列に希釈する。ISCAを充填するには、27ゲージの針を1ミリリットルのシリンジに取り付け、濾過された化学誘引剤の濃度ごとに1つの注射器をロードします。ポートを上向きにしてデバイスを保持し、小さな液滴が各ポートの上に現れるまで、デバイスの1行の5つの井戸のそれぞれに物質の各濃度をゆっくりと注入します。
すべてのウェルが満杯になったら、適切な細菌培養培地の150ミリリットルに関心のある海洋または淡水細菌培養物の1.5ミリリットルを移す。次に、200ミリリットルの容量トレイの平らな表面に両面粘着テープを2枚置きます。また、テープの各部分に1つのISCAを固定します。
50ミリリットルの血清ピペットを使用して、ゆっくりと細菌溶液で展開トレイを充填します。そして、細菌が1時間の関心の化学誘引剤に応答することを可能にします。分析を終了するには、新しい50ミリリットルのピペットを使用して、ISCAトレイから培地を静かに取り除きます。
サンプルを取得するには、ポートが下向きになるように ISCA を最初に配置します。次に、27ゲージ針を備えた滅菌1ミリリットルの注射器を使用して、各ウェルから溶液を引き出す。同じ濃度の各列からサンプルを単一のチューブに引き出す。
次に、フローサイトメトリーでサンプルを分析し、各化学誘引体濃度に引き付けられる菌の数を決定する。現場展開用のISCAを準備するには、まず、フィールド側からISCAあたり5ミリリットルの水を収集し、0.2マイクロメートルのシリンジフィルターを通して50ミリリットルの円錐管に水をろ過します。シリンジを濾過した水を親水性GPフィルターカートリッジを2回通し、各リンスの後に新しい50ミリリットル円錐形遠心分離管に濾液を採取する。
次に、0.02マイクロメートルのシリンジフィルターを通して水を新しい50ミリリットルチューブにろ過します。濾液のアリコートを使用して、関心のあるすべての化学誘引物質を、個々の15ミリリットルの円錐管内の所望の濃度に再懸濁させる。その後、10ミリリットルのシリンジを使用して、個々の0.2マイクロメートルのシリンジフィルターを通して、不要な粒子または水不溶性化合物を除去するために、滅菌15ミリリットル円錐形遠心分離管に再懸濁された化学誘引物質を濾過します。
ISCA フィールド展開の場合は、各 ISCA をデバイス・エンクロージャーのピース 9 にねじ込み、エンクロージャーを閉じます。粘着テープでエンクロージャを密封し、バンジーコードを使用してエンクロージャを展開アームと人間製の構造に固定します。あるいは、エンクロージャは浅い基質の小さい重量で固定されるか、またはペラジック海の網に取り付けることができる。
エンクロージャを完全に沈め、充填を開始し、エンクロージャをしっかりと保持して内部の過度の水の動きを防ぎます。水のレベルがエンクロージャの上部に達したら、空気が内部に閉じ込められないようにしてください。エンクロージャが完全に満杯になったら、底部と上の穴を2つのプラグで密封します。
その後、ISCAを1〜3時間所定の位置に置いたままにしておきます。サンプリング期間の終了時に、水からエンクロージャを取り外します。容器の上にエンクロージャを置いて水を排出し、慎重に前面の穴から粘着テープの上部を取り除きます。
水ラインがISCAの上部の下を通過したら、底栓を取り外し、残りの水を排出します。ISCAがまだエンクロージャに取り付けられている間、1ミリリットルのピペットまたは1ミリリットルのシリンジを使用して、各ISCAの上に閉じ込められた水を慎重に取り除き、上面に触れることなくISCAを取り除きます。次に、使い捨てワイプを使用して表面に残っている液体を取り除き、実験室のサンプル検索のために示されているようにサンプルを取り出します。
この代表的なin vitro分析では、1ミリモルは、濾過された海水制御よりも18倍高い有意な化学戦術応答を誘導したため、最適なグルタミン導入濃度であると判断した。グルタミンの高いおよび低濃度はまた、有意な誘発, しかし、弱い, 化学戦術応答.この現場展開分析では、オーストラリアのシドニー近郊の沿岸地域に1ミリモルグルタミンで満たされた5つのISCA複製物を1時間配備した。
そして、グルタミンを満たしたISCAは、ろ過された海水で満たされた対照井戸よりも3倍近くの細菌を引き付けました。ISCA をラボと現場の両方に展開する際に覚えておくべきことは、強い流体フローを作成して、気胸を防ぐことです。ISCA由来のサンプルは、特定の生物または遺伝子を同定し、化学戦術生物のゲノム電位を特徴付け、選択的培地上の特定の株の標的分離に使用することができる。
