Использование этого протокола для удаления межпрофаймных вариаций может дать представление о дифференциальном регулировании макромолекул, основанных на внутрипрофаймных расхождениях между уровнями мРНК и белка. Использование одного и того же образца для изоляции ДНК, РНК и белка является попыткой уменьшить изменчивость, улучшить воспроизводимость и облегчить интерпретацию. Преимущества включают в себя сэкономленное время и ресурсы во время сбора выборки и поперечного анализа ценных и ограниченных образцов.
Для начала семя 1000 яиц червя в одной 10-сантиметровой пластине с соответствующими условиями роста. Инкубировать при 20 градусах по Цельсию в течение 72 часов. Затем вымойте тарелку с 5 миллилитров буфера M9 и передать 1000 взрослых червей в трубку.
Центрифуга червей на 1000 г в течение одной минуты, отбросить супернатант, и передать гранулированных червей, с одним миллилитром буфера M9, в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки. Центрифуга снова на 845 г в течение одной минуты и отказаться от большинства супернатантов. Храните гранулы червей при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение более четырех часов.
Затем удалите любой супернатант из разморожевания гранул. Добавьте один миллилитр холодного реагента GTCP, хорошо перемешайте, трубя вверх и вниз, и поместите образец на лед в течение 10 минут. Затем добавьте 200 микролитров холодного хлороформа.
Встряхните трубку энергично в течение 15 секунд и оставить его при комнатной температуре в течение трех минут. Затем центрифуга трубки при 13 500 г при четырех градусах Цельсия в течение 15 минут. С помощью микро-пипетки перенесите ясный верхний слой в новую трубчатую трубку с микро центрифугой без RNase.
Перенесите мутный белый межфазный слой в новую трубку с пометкой B2 и перенесите розовый слой из оставшейся гранулы в новую трубку с пометкой B и поместите ее на лед. Простое разделение трех слоев может быть затруднено. Я рекомендую передать облачный межфазный слой в его собственную трубку, а не осаждать ДНК из этого слоя из органического, или розового слоя.
Чтобы изолировать РНК, сначала добавьте 500 микролитров 100%изопропанола в трубку А, чтобы вызвать РНК. Затем инкубировать трубку при комнатной температуре в течение 10 минут. После инкубации центрифуга трубки при 13 500 г при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.
Затем отбросьте супернатант и добавьте один миллилитр 75%этанола в трубку А для мытья гранул. Центрифуга трубки при 5 300 г при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и дайте грануле высохнуть в течение пяти-десяти минут.
Добавьте 50 микролитров воды без RNase, чтобы восстановить гранулы РНК и инкубировать гранулы при 55 до 60 градусов по Цельсию в течение 10 минут, чтобы растворить его. Наконец, используйте спектрофотометр для измерения концентрации изолированной РНК на 260 нанометров и выявления любых примесей на 230 и 280 нанометров. Чтобы изолировать ДНК, сначала добавьте 300 микролитров 100% этанола в органическую фазу в трубке В и в мутный белый слой в трубке В2, чтобы вызвать ДНК, смешать инверсией и оставить трубки при комнатной температуре на две-три минуты.
Затем, центрифуга трубки B и B2 при 376 г при четырех градусах цельсия в течение пяти минут, чтобы гранулировать ДНК. Объедините супернатант из труб B и B2 в новую двухми миллилитровую трубку с маркировкой C и оставьте на льду для последующей белковой изоляции. Затем вымойте гранулы ДНК в трубке B2 с одним миллилитром 0,1 молярного цитрата натрия в 10% этанола в течение 30 минут.
Центрифугная трубка B2 при 376 г при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Повторите шаг мытья, а затем повторно приостановить гранулы в 1,5 миллилитров 75%этанола и оставить его при комнатной температуре в течение 20 минут. Далее, центрифуга трубки B2 при 376 г при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут, а затем отказаться от супернатанта и дать гранулы высохнуть в течение пяти до 10 минут.
Растворите гранулы в 150 микролитерах восьмими миллилитров гидроксида натрия. Затем центрифуга образца на 376 г при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Наконец, с помощью микропипетта перенесите супернатант, содержащий ДНК, в новую трубку.
Используйте спектрофотометр для измерения концентрации изолированной ДНК на 260 нанометров и выявления любых примесей на 230 и 280 нанометров. Чтобы вызвать белок, сначала добавьте до 1,5 миллилитров 100%изопропанола в розовый супернатант в трубке С, перемешайте несколько раз и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем центрифуга трубки С при 13 500 г при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.
Откажитесь от супернатанта и промойте гранулы двумя миллилитров 0,3 молярного гидрохлорида гуанидина в 95% этанола в течение 20 минут при комнатной температуре. Центрифуга трубки снова на 5, 300 г при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут и повторить шаг мытья, как раньше. Перенесите белковую гранулу в новую 1,5 миллилитровую трубку с маркировкой C2 и добавьте до 1,5 миллилитров этанола, вихря, и дайте ему сидеть при комнатной температуре в течение 20 минут.
Центрифуга трубки при 5 300 г при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и дайте грануле высохнуть при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем растворите гранулы в 300 микролитров 5%SDS при 50 градусах по Цельсию в течение 60 минут.
Наконец, центрифуга трубки при 13 500 г при 17 градусах Цельсия в течение 10 минут. И перенесите супернатант, содержащий белок, в новую трубку. Для выполнения количественной обратной транскрипции ПЦР.
Во-первых, используйте одну нанограмму изолированной РНК для подготовки к РДНА путем обратной транскрипции. Чтобы сделать склад пластины cDNA, добавить 100 микролитров от одного до 100 разбавления каждого образца cDNA для отдельных скважин 96 пластины скважины, включают соответствующие элементы управления, такие как вода только скважины и последовательно разбавленных образцов, чтобы установить эффективность грунтовки для каждого гена. Чтобы сделать мастер смесь для каждого набора грунтовки, добавить до семи микролитров воды, ДНК-интеркалирования цианида красителя, и пять микро-моляров каждый из вперед и обратно грунтовки.
Добавьте семь микролитров мастер-микса к соответствующим скважинам пластины RT-qPCR. Затем добавьте три микролитера cDNA из фондовой пластины и запустите пластину с помощью протокола RT-qPCR, пригодного для использования грунтовок. Для подтверждения целей, выявленных анализом РНК, был проведен анализ отдельных мРНК из четырех независимых образцов трех штаммов червей.
F07C4.12 ген был upregulated в обоих анализах в eat-2 червей, но его upregulation в rsks-1 червей не был обнаружен анализ RT-qPCR. Кроме того, РНК seq обнаружила изменения экспрессии mrp-1 у червей eat-2 и rsks-1, которые были подтверждены с помощью RT-qPCR. Upregulation или down-regulation генов маркеров органеллы у червей-мутантов также были обнаружены в результате анализа RT-qPCR.
Сравнение GTCp с RIPA-извлеченным белком у червей, разделенных страницей SDS и окрашенных в кумасси синий показал аналогичное качество с лучшим разрешением больших белков для GTCp извлеченных белков. Западный анализ помарки показал подобные уровни протеина в большинств случаи;однако, протеины большле чем 75 kilodalton показали более низкие уровни в RIPA-извлеченных протеине. Сравнение целевых показателей мРНК и уровней белка из четырех отдельных образцов трех штаммов червей показало низкую изменчивость уровней мРНК с большей изменчивостью на уровне белка.
В контексте изоляции ДНК, выход сильно зависит от мастерства для восстановления облачного межфазного слоя из органического, или розовый, слой. Для улучшения растворения белков из гранул может потребоваться увеличение объема буфера повторной виолонтилизации или добавление других моющих средств, помимо SDS. Использование этого метода может помочь правильно определить случаи, когда перевод мРНК на белок не является основным и может привести к более глубокому расследованию пост-транскриптионных и пост-трансляционных механизмов регулирования при различных условиях.
В нашей лаборатории этот протокол используется для сохранения ценных и ограниченных времен основных образцов. Кроме того, я могу себе представить, что это был бы полезный протокол для принятия в циркадном ритм-поле. Реагент GCTP и растворители, используемые в изоляции РНК, представляют опасность и должны использоваться с осторожностью.
