Мы хотели бы выразить признательность финансирование от Национального института здоровья (R15 GM065444-03 Л. Б.) и Внутренние программы исследований Национального института здоровья (NIH) и Национального института диабета, желудочно-кишечных и почечных заболеваний (KO). Награда NSF (DBI-0923402), финансируемых приобретение LSM700 конфокальной микроскопии. Мы также хотели бы отметить общую помощь и полезные замечания по рукописи от доктора Энди Голден. Заслуга всей C. Элеганс сообщества для совместного использования ресурсов, протоколов и идей.

1. Нематоды культур <ol><li> Получить соответствующие C. Элеганс напряжение от Caenorhabditis генетики сток центр (CGC), либо из коллег. </li><li> Расти нематод на NGM пластин агара с присадками OP50 бактериальных газон (3). Для анализа роста GFP штаммов при 25 ° С рекомендуется. </li><li> День до микроскопии эксперимента, подобрать не менее 40 L4 личинок на тарелки посеяны и место пластин при 25 ° С в течение ночи. Эти черви будут молодые люди для эксперимента. </li></ol> 2. Инъекции Если желательно, чтобы посмотреть в структурах, таких как лизосомы и митохондрии, взрослые могут быть введены с флуоресцентным красителем до визуализации. <ol><li> Подготовка сушеных инъекции агарозном колодки. (Это можно сделать от одного до многих дней заранее) <ol><li> Подготовка расплавленного 2% агарозном в воде. С пипетки Пастера положить по 2 капли на покровного стекла 22X54 мм. Место другой покровного стекла крест-накрест на вершине капли. Для достижения необходимой толщины, нажмите на верхнюю покровного стекла, пока диаметр площадки составляет около 1,5 см. Дайте настояться в течение 5-10 минут. </li><li> Снимите верхнюю покровного стекла. Дегидрировать площадку агарозы, поместив его в 80 ° С духовке в течение 1 часа и не допускайте, чтобы сидеть на настольный ночь. </li></ol></li><li> Подготовка Mitotracker или Lysotracker решение. <ol><li> Развести флуоресцентный агент в яйцо буфера. Обычно мы используем 1:10 разбавление Mitotracker или Lysotracker. </li><li> Инъекционной иглой выполнена из 1,2 OD стеклянный капилляр. Вытяните инъекционной иглой с помощью иглы съемника. </li><li> Используйте вытащил Pastuer пипетки, чтобы заполнить назад иглу с разбавленной краской. </li><li> Место иголку в свет без, влажной камере до момента использования. </li></ol></li><li> Предварительная инъекция: Настройка микроскопа и иглы. <ol><li> Горы инъекционной иглой на инъекции аппарата. Наш аппарат Narishige прямой микроманипулятора привод установлен на стадии Nikon TE200 инвертированный микроскоп оснащен DIC возможности визуализации. </li><li> Подключите иглы 1,2 мм ID трубка, которая подключается к регулятор давления. Либо сжатого воздуха или азота может быть использован в качестве внешнего источника давления. Установите регулятор на 20-25 фунтов на кв. </li><li> Место 2 капли тяжелых нефтепродуктов (Парафиновые масла) на инъекцию площадку. </li><li> Место инъекции площадку на микроскоп и нижней иглы в масле. Убедитесь, что потоки жидкости свободно от иглы, когда под давлением. Применять давление впрыска и наблюдать ли жидкость вытекает из иглы. Если нет, то вам необходимо аккуратно разорвать конце иглы. Игла может быть нарушена, осторожно вождения наконечник в маленький кусочек сломанной покровного стекла размещены на инъекции площадку. После иглы течет, переходите к следующему шагу. </li></ol></li><li> Injection. <ol><li> Примерно за 1 час до просмотра эмбрионов, передача молодых взрослых червей в нефть падают на инъекции площадку. Выполните эту передачу, которая использует рассекает микроскопом. Используйте червя платиновой проволоки забрать с заостренным концом для передачи червей. </li><li> Организовать 3 - 10 червей, так что они лежат прямо на площадке. Для инъекций, проще всего, если черви выстроились параллельно друг другу и чуть менее червь длиной друг от друга. Как только черви на инъекции площадки важно работать быстро и полное введение процесса, прежде чем черви погибают от высыхания. </li><li> Место покровного стекла с червями на столике микроскопа инжекции микроскопом. Фокус в центральной части (осью) дистального трубки гонады. Затем с помощью микроманипулятора для перемещения кончика иглы в той же фокальной плоскости. Перемещение этапе горизонтально, так что червь проткнуть иглой. Как только кончик иглы в позвоночник, давление и позволит гонады заполнить красителя смеси. Inject как гонады оружие всех червей на инъекции площадку. </li><li> После инъекции, использование пипетки Пастера вытащил поставлять около 0,5 мл Яйцо буфера для червей. Это позволит сохранить их от смерти в результате обезвоживания и дать им возможность оправиться от введения процедуры. </li><li> Разрешить червей восстановить в течение 1-2 часов при комнатной температуре в свет без, влажной камере. </li></ol></li></ol> 3. Агарозном площадку для просмотра эмбрионов <ol><li> Подготовка расплавленного 2% агарозном в яйцо буфера. </li><li> С помощью пипетки Пастера, положить 3 капли расплавленного агарозы на чистую слайд микроскопом. </li><li> Место слайда между двумя другими слайдами, которые имеют один слой маркировки ленту, закрывающую их. Они служат прокладками, которые обеспечат ваш агарозном прокладка правильной толщины. </li><li> Место второго чистой микроскопический слайд перпендикулярно вниз на агарозном капель. Пресс вниз, пока верхний слайд покоится на ленту с руководством слайдов. </li><li> Просто, прежде чем вы готовы монтировать эмбрионов для наблюдения, снимите верхнюю слайд. </li></ol><ol><li> Если черви не были введены, выполните следующие два шага. В противном случае их пропустить. <ol><li> Выберите молодых взрослых червей от пластины, который был подготовлен накануне. Вы должны быть в состоянии видеть эмбрионами внутри молодых взрослых. </li><li> Выберите 5-20 червей на unseeded пластины NGM. Разрешить черви ползают по unseeded пластине в течение нескольких минут, так что черви теряют большую часть бактерий, которые привязаны к ним. </li></ol></li><li> Получить молодые эмбрионы от взрослых червей <ol><li> Место 5-20 мкл капли Яйцо буфер в середине 18 мм 2 стекла покровного стекла (покровного стекла толщиной 1,5 предпочтительнее). </li><li> Перемещение червей unseeded пластины или инъекции площадку в капле Яйцо буфера. </li><li> Разрежьте черви с 26 иглы подкожных колеи. Разрежьте червь возле вульвы. Вы должны увидеть эмбрионы высыпался из червя. </li></ol></li><li> Горы на предметное стекло микроскопа <ol><li> Обратить стекло микроскопа, который был подготовлен с площадкой агарозы и опустите его на покровного стекла с эмбрионами. </li><li> Если расширенные промежуток времени требуется, используйте вазелин, чтобы запечатать края покровного стекла для предотвращения высыхания. </li></ol></li></ol> 5. Микроскопия <ol><li> Поиск соответствующих эмбрионов. <ol><li> Место слайд на предметный столик микроскопа. Сканирование с 10х объектив, чтобы найти эмбрионов. </li><li> Чтобы найти ранней стадии эмбрионы, поиск эмбрионов, которые находятся в процессе завершения материнской мейоза. Мейотического эмбрионы можно отличить от более поздних эмбрионов, поскольку они не подверглись сокращению. (После того, эмбрионы завершили мейоза, можно увидеть значительный разрыв между клеточной мембраны и яичной скорлупы на переднем конце.) </li><li> После того как вы определили надлежащим поставил эмбриона, перейти к более высоким увеличением линзы для записи эмбриогенеза. </li></ol></li><li> Изображений <ol><li> В этом примере мы воображая эмбрионов, которые выражают mCherry:: H2B и GFP:: Ub меткой белков. Мы используем Zeiss LSM700 обычного микроскопа сканирующего лазера. </li><li> Изображения получены с помощью 63x 1.4NA линзы. 488 и 555 используются лазеры с минимальной мощности лазера и максимальное усиление. Я стек собирается каждые 10-15 секунд. В зависимости от степени фотообесцвечивания, 30-60 моменты времени собираются. Изображений Z стека рухнул в максимальной проекции изображения для окончательного покадровой видео. </li></ol></li></ol> 6. Представитель Результаты: <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Оплодотворение с первого митоза в C. Элеганс. <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. Микроинъекция процедуры. Справочная Видео 1 Покадровый видео GFP:.. Убиквитин плюс Lysotracker синего в мейотических эмбриона <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2852/2852fig3.avi">Щелкните здесь для просмотра видео.</a>

<ol>
	<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833-e833 (2008).</li><li>Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgenic+C.+elegans+by+Biolistic+Transformation.">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation.</a> J Vis Exp. (42), e2090-e2090 (2010).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetics+of+Caenrohabditis+elegans.">The Genetics of Caenrohabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Oegema, K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division+WormBook.">Cell division WormBook.</a> , (2006).</li><li>McNally, K. L., McNally, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+initiates+the+transition+from+anaphase+I+to+metaphase+II+during+female+meiosis+in+C.+elegans.">Fertilization initiates the transition from anaphase I to metaphase II during female meiosis in C. elegans.</a> Dev Biol. 282, 218-230 (2005).</li><li>Sato, K., Sato, M., Audhya, A., Oegema, K., Schweinsberg, P., Grant, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+caveolin-1+trafficking+in+the+germ+line+and+embryo+of+Caenorhabditis+elegans.">Dynamic regulation of caveolin-1 trafficking in the germ line and embryo of Caenorhabditis elegans.</a> Mol Biol Cell. 17, 3085-3094 (2006).</li><li>Stitzel, M. L., Pellettieri, J., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+DYRK+Kinase+MBK-2+Marks+Oocyte+Proteins+for+Degradation+in+Response+to+Meiotic+Maturation.">The C. elegans DYRK Kinase MBK-2 Marks Oocyte Proteins for Degradation in Response to Meiotic Maturation.</a> Curr Biol. 16, 56-62 (2006).</li><li>Schetter, A., Askjaer, P., Piano, F., Mattaj, I., Kemphues, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoporins+NPP-1,+NPP-3,+NPP-4,+NPP-11+and+NPP-13+are+required+for+proper+spindle+orientation+in+C.+elegans.">Nucleoporins NPP-1, NPP-3, NPP-4, NPP-11 and NPP-13 are required for proper spindle orientation in C. elegans.</a> Dev. Biol. 289, 360-371 (2006).</li><li>Samuel, A. D., Murthy, V. N., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+during+fertilization+in+C.+elegans.">Calcium dynamics during fertilization in C. elegans.</a> BMC Dev Biol. 1, (2001).</li><li>Badrinath, A. S., White, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+patterns+of+mitochondrial+redistribution+in+the+early+lineages+of+Caenorhabditis+elegans+and+Acrobeloides+sp.+PS1146.">Contrasting patterns of mitochondrial redistribution in the early lineages of Caenorhabditis elegans and Acrobeloides sp. PS1146.</a> Dev. Biol. 258, 270-275 (2003).</li><li>Johnston, W. L., Krizus, A., Dennis, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eggshell+is+required+for+meiotic+fidelity,+polar-body+extrusion+and+polarization+of+the+C.+elegans+embryo.">The eggshell is required for meiotic fidelity, polar-body extrusion and polarization of the C. elegans embryo.</a> BMC Biol. 4, 35-35 (2006).</li><li>Parry, J. M., Velarde, N. V., Lefkovith, A. J., Zegarek, M. H., Hang, J. S., Ohm, J., Klancer, R., Maruyama, R., Druzhinina, M. K., Grant, B. D., Piano, F., Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGG-4+and+EGG-5+Link+Events+of+the+Oocyte-to-Embryo+Transition+with+Meiotic+Progression+in+C.+elegans.">EGG-4 and EGG-5 Link Events of the Oocyte-to-Embryo Transition with Meiotic Progression in C. elegans.</a> Curr Biol. 19, 1752-1757 (2009).</li><li>Centonze, V. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+excitation+provides+optical+sections+from+deeper+within+scattering+specimens+than+confocal+imaging.">Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging.</a> Biophys J. 75, 2015-2024 (1998).</li><li>Zinselmeyer, B. H., Dempster, J., Wokosin, D. L., Cannon, J. J., Pless, R., Parker, I., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+and+multidimensional+analysis+of+cell+dynamics.">Two-photon microscopy and multidimensional analysis of cell dynamics.</a> Methods Enzymol. 461, 349-378 (2009).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

После слияния с сперма, зиготы претерпевает ряд динамических событий. Эти события трансформировать яйцеклетки из относительно статичные клетки в быстро развивающемся эмбрионе. Во многих организмов, цитоплазматические перестановки являются критически важными для создания эмбриональных полярности и яйца активации. C. Элеганс эмбрионов дает прекрасную возможность для наблюдения этих ранних событий активации яйца и эмбриогенеза. Эмбрион является прозрачной и на ранних стадиях развития событий относительно быстро после оплодотворения. C. Элеганс исследователи вызвали много полезных трансгенных линий, которые выражают флуоресцентно меченых белков, участвующих в раннем развитии. С помощью этих штаммов, а также РНК-интерференции или мутанты обеспечивает мощная система для вскрытия молекулярных путей, которые лежат в основе развития многоклеточного организма (5, 6, 7, 8). Это видео статье представлен практический подход к использованию этих средств и методов для записи событий во время раннего эмбриогенеза в C. Элеганс. Зрелая С. Элеганс ооцитов арестован в профазе мейоза I и оплодотворяется в сперматекой из взрослых гермафродитом. После оплодотворения яйцеклетки происходит через оставшуюся часть мейоза I и II. Эти этапы можно наблюдать с помощью флуоресцентно меченных гистонов H2B (5). Во время завершения материнской мейоз, ДНК спермы остается конденсированных (см. Рисунок 1). После завершения мейоза, материнской и отцовской ДНК становится деконденсированных и два пронуклеусы форме. Материнской пронуклеус мигрирует к отцовской пронуклеус и они объединяются недалеко от центра зародыша. Митоз быстро наступает после пронуклеусов встречи. Все эти события происходят в меньше чем за час. Таким образом, замедленная микроскопии этой последовательности событий может быть легко достигнута. Выполнение этой техники требует определенного объекта в нематода культивирования, а также основные навыки микроскопии в дополнение к доступу к конфокальной микроскопии. Например, представленные здесь используются трансгенные C. Элеганс штамм, который выражает две флуоресцентные белки, GFP:: убиквитин и mCherry:: H2B. Конфокальной лазерной сканирующей микроскопии используется для наблюдения динамической локализации этих двух белков. Кроме того, мы показали, что инъекции флуоресцентно меченных Lysotracker могут быть использованы для проследить судьбу лизосом у эмбриона после оплодотворения. Введение меченых трекер может быть выполнена для визуализации митохондрий или местные концентрации кальция (9). В теории, введение протокол может быть использован для просмотра любого типа флуоресцентно меченных молекул в зародыше. Это могут быть помечены малых молекул, белков, липидов и т.д. В некоторых случаях она может и не понадобиться, чтобы фактически вводят помечены трекеры, как черви легко поглощение некоторых красителей, таких как mitotracker (10). Тем не менее, мы постарались как замачивания и инъекции lysotracker и нашли намного лучшие результаты с впрыском для визуализации в эмбрионы. Технические соображения: Технических проблем, возникающих с помощью этой процедуры включают микроинъекции техники, а также трудности в области обработки изображений очень ранних эмбрионов. Что касается микроинъекции, толщина площадки инъекции агарозном имеет решающее значение для успешного инъекций. Если подушка слишком толстый, черви осушать и быстро погибают. Если подушка слишком тонкий, черви не будет прилипать к площадке во время процесса впрыска. Ранние эмбрионы могут быть чувствительны к условиям окружающей среды, таких как температура и буферных условиях. Дикие эмбрионов типа должны инициировать деконденсации ДНК спермы и пронуклеусов миграции в минуту или около завершения мейоза II (4). В течение 20 минут, первый цитокинеза должна начаться. Если эмбрионы подвергаются воздействию очень высокой интенсивности лазерного излучения или перегреве или измельченные в период монтажа, этот процесс может быть сорван. Такие эмбрионы будут ареста развития. Если это происходит, эксперимент должен быть повторен с пониженной мощности лазера или толще агарозном площадку. C. Элеганс эмбрионов не выделяют их яичной скорлупы, пока вскоре после оплодотворения. В течение короткого времени между оплодотворением и секрецию яичной скорлупы, эмбрионы не являются жизнеспособными вне матери (11). Некоторые лаборатории бы избежать этой проблемы путем изображения эмбрионов внутриутробно (5, 12). Внутриутробное изображений дает определенные преимущества, такие как возможность захвата событий, которые происходят во время или сразу после оплодотворения. Однако этот метод требует использования микроскопии система, которая позволяет производить глубокое изображение ткани. Такие системы, как двухфотонной или многофотонной особенно подходят для этого (13, 14). При использовании обычного лазерного сканирования или вращающийся диск конфокальной микроскопии, лучшие изображения получаются из эмбрионов, которые гапосетили вырезанных из взрослого червя, как описано здесь. Соображения Imaging System: Тип конфокальной системы визуализации используется, зависит от потребностей пользователей. В общем, лазерные сканирующие системы, рекомендуется, если мы хотим получать изображения с максимально возможным разрешением. С другой стороны, спиннинг дисковые системы лучше подходят для работы с изображениями высокой динамичностью процессов, как получение изображений является относительно быстрым и фотообесцвечивания / фототоксичности снижается. Конкретные параметры съемки будут варьироваться в зависимости от опытно-конструкторских и конфокальной системы визуализации работу. В многомерной визуализации, необходимо рассмотреть количество каналов, фокальные плоскости и временных точках собираются. Из-за предельной эффекты фотообесцвечивания и фототоксичности, конечное количество изображений может быть приобретен в той или иной эксперимент. Таким образом, если вы решили увеличить количество каналов приобретается, вы, вероятно, необходимо сократить число фокальных плоскостей и / или временных точках, и наоборот. Общее количество изображений, которые могут быть приобретены будет зависеть от интенсивности флуорофора время отображаемого, а также чувствительность конфокальной микроскопии используется. Более интенсивный флуорофоров и более чувствительных приборов потребует сокращения времени воздействия и, следовательно, производить меньше фотообесцвечивания и фототоксичности. Большое количество изображений или системы имеются. Мы дадим подробную информацию о системах, которые были использованы в наших собственных лабораториях. Для визуализации червя эмбрионов на вращающийся диск конфокальной микроскопии, мы используем Nikon TE2000U инвертированный микроскоп оснащен 60X/1.4 Н. А. Plan Apo цели. Микроскоп подключен к Yokogawa CSU10 вращающийся диск устройства, Hamamatsu C9100-13 EM ПЗС-камеры, и спектральные прикладных исследований LMM5 лазерных модуля слияния, содержащий четыре твердотельных лазеров с выходной при 405, 491, 561 и 655 нм. С помощью этой системы мы можем захватить один или два канала, от шести до двенадцати фокальных плоскостях, а также от 25 до 50 timepoints (на 30 до 60 секундными интервалами). Типичное время экспозиции составляет от 100 до 200 миллисекунд. Для изображения эмбрионов с лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, мы используем Zeiss LSM700 оснащен 2 канала и четыре твердотельных лазеров (405, 488, 555 и 635 нм). Эта система крепится к наблюдатель Zeiss Axio инвертированный микроскоп с планом-Апо 63X/1.4NA цели используются для эмбриона изображений. Система использует Zeiss ZEN программное обеспечение для получения изображений, который также предоставляет ограниченную обработки и анализа изображений. При визуализации с двумя флуорохромами, мы обычно собирают 1-5 фокальных плоскостях (~ 0,5 мкм друг от друга) и собрать стек Z каждые 15 секунд. Коллекции продолжалось до значительных фотообесцвечивания произошло. Для формирования окончательной покадровой видео, изображения Z стека консолидированного использованием максимального инструмент проектирования в ZEN программного обеспечения. Видео вывозятся с программным обеспечением в виде файлов AVI.

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th><th> Композиция </th></tr><tr><td> Яйцо буфера </td><td></td><td></td><td> 5 мМ рН Hepes 7.2, 110 мм NaCl, KCl 4мм, 5мм ацетат магния, 5 мМ CaCl 2 </td></tr><tr><td> Mitotracker </td><td> Invitrogen </td><td> M-7512 </td><td></td></tr><tr><td> Lysotracker </td><td> Invitrogen </td><td> L-7525 </td><td></td></tr><tr><td> Инъекция капиллярной пипеткой </td><td> Гарвардский аппарата, графство Кент, Великобритания </td><td> GC120F-10 </td><td></td></tr><tr><td> Иглы Puller </td><td> Kopf </td><td> Модель 700C </td><td></td></tr><tr><td> Аппарат Microinjector </td><td> Tritech исследований </td><td> MINJ-1 микроинъекции регулятора </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse microscopy of early embryogenesis in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis Элеганс часто используется в качестве модельной системы для изучения ранних процессов развития. Прозрачность эмбрионов, генетических ресурсов, и относительная легкость трансформации качества, которые делают C. Элеганс отличной моделью для раннего эмбриогенеза. Лазерная основе конфокальной микроскопии и флуоресцентно меченных теги позволяют исследователям следить специфических клеточных структур и белков в развивающемся эмбрионе. Например, можно проследить конкретные органелл, таких как лизосомы и митохондрии, используя флуоресцентно меченных красителями. Эти красители могут быть доставлены раннего эмбриона с помощью микроинъекции во взрослую гонады. Кроме того, локализация специфических белков может сопровождаться использованием флуоресцентных меток белка. Примеры, представленные здесь, демонстрирующие использование флуоресцентных красителей лизосомальных а также флуоресцентно меткой гистонов и убиквитин белков. Помечены гистонов используется для визуализации ДНК и таким образом определить стадию клеточного цикла. GFP с метками убиквитин раскрывает динамику ubiquitinated пузырьков в начале эмбриона. Наблюдения меченых лизосомы и GFP:: убиквитин могут быть использованы, чтобы определить, есть ли между колокализации ubiquitinated пузырьков и лизосом. Методика микроинъекции лизосомальных красителя представлена. Методы для создания transgenenic штаммов представлены в другом месте (1, 2). Для обработки изображений, эмбрионов, вырезанных из взрослых нематод гермафродит и установлен на 2% агарозном колодки следует покадровой микроскопии на стандартной лазерной сканирующей конфокальной микроскопии или вращающийся диск конфокальной микроскопии. Эта методология предусматривает высокую визуализации разрешение раннего эмбриогенеза.

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

В этой статье описывается методика визуализации ранних событий эмбриогенеза в нематода<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt;.

Покадровый Микроскопия раннего эмбриогенеза в Caenorhabditis Элеганс

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

time-lapse-microscopy-of-early-embryogenesis-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

17.8K Views.  University of Alabama in Huntsville. В этой статье описывается методика визуализации ранних событий эмбриогенеза в нематода Caenorhabditis Элеганс.

Video: Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Мониторинг актина Разборка с покадровой микроскопии

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Покадровый Визуализация Митоз После трансфекции миРНК

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

Выделение и В пробирке Активация Caenorhabditis Элеганс Сперма

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Количественный анализ случайных миграции клеток помощью замедленной видео микроскопии

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Основной<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Методы синхронизации и наблюдения

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

Использование времени Lapse микроскопии для визуализации Anoxia вызванных Подвесные анимации в<em&gt; C. Элеганс</em&gt; Эмбрионы

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Добыча простагландинов и анализа в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Измерение коэффициентов потребления кислорода в неповрежденной Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Специфическая маркировка митохондриальных нуклеоидов для time-lapse Структурированная микроскопия освещения

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

Безметчная визуализация динамики накопления липидов у caenorhabditis elegans с использованием стимулированной рамановской рассеянной микроскопии

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...