Live-Cell Bdellovibrio бактериоворная визуализация была сложной из-за сложного жизненного цикла этих хищных бактерий. Наш протокол позволяет контролировать этапы полного жизненного цикла в режиме реального времени. Хотя наш протокол основан на конкретных уравнять штаммы, он может быть легко адаптирован к различным бактериальным штаммам, включая патогенные штаммы.
Чтобы создать культуру B.bacteriovorus, объединить один миллилитр свежих 24-часовых культурных бактерий с тремя миллилитров ночной культуры добычи в 250 миллилитров колбы, содержащей 50 миллилитров кальция хиппи буфер дополнен антибиотиками по мере необходимости. После 24-часовой инкубации при 30 градусах по Цельсию и 200 оборотов в минуту, убедитесь, что клетки добычи были полностью облизаны жидкой контрастной микроскопией лица. Многочисленные многонаступенчатые фазированные клетки B.bacteriovorus должны присутствовать и не должны быть видны клетки E.coli или bdelloplast.
Процедите культуру B.bacteriovorus через фильтр размером 0,45 микрометра в 50-миллилитровую коническую трубку и приостановите филтрат в центрифуге. Затем повторно приостанавливайте гранулы B.bacteriovorus в трех миллилитров кальция хиппи буфера до окончательной оптической плотности на 600 нанометров примерно 0,2 и инкубировать бактерии при 30 градусов по Цельсию и 200 оборотов в минуту в течение 30 минут. Чтобы подготовить клетки-хозяина, выберите одну колонию из штамма хозяина интереса и кинулировать бактерии в 10 миллилитров YT среды дополняется антибиотиками по мере необходимости для ночной инкубации при 37 градусов по Цельсию и 180 оборотов в минуту.
На следующее утро перенесите два миллилитров ночной культуры в двухми миллилитровую пробирку и гранулируемые клетки центрифугированием. Затем повторно приостановить гранулы в 200 микролитров кальция хиппи буфера. Очень важно полностью повторно приостановить всю ячейку гранулы после центрифугации, чтобы убедиться, что клетка добычи разделены на уровне одной клетки.
Чтобы подготовить клетки к замедленной микроскопии, во-первых, смешайте 200 миллиграммов низкофлуоресцентной молекулярной градозы с 20 миллилитров буфера хиппи кальция и растворите агарозу в микроволновке. Налейте три миллилитров расплавленной агарозы в 35-миллиметровую стеклянную нижнюю тарелку и дайте агарозе затвердеть. Используя лабораторный микро шпатель, тщательно удалите агарозную площадку из тарелки, не нарушая центральный полюс колодки и поместите нижнюю сторону площадки вверх на крышку чашки Петри.
Поместите пять микролитров концентрированной подвески клетки-хозяина на перевернутую площадку и используйте цикл прививки для распространения клеток в центре полюса. Далее добавьте пять микролитров концентрированной подвески B.bacteriovorus на поверхность клетки-хозяина, не распространяясь и быстро верните гель в 35-миллилитровую стеклянную нижнюю часть блюда вверху вниз. Затем накройте блюдо крышкой.
Для микроскопии Time-Lapse Florescence совместной культуры поместите блюдо в держатель чашки Петри таким образом, чтобы блюдо не двигаться в течение эксперимента и поместите одну каплю масла погружения на перевернутый микроскоп цели и одну каплю на дне блюда. Установите держатель на сцену микроскопа в перевернутой камере микроскопа и в микроскоп программное обеспечение установить увеличение до 100X и полихромный объектив для GFP и Mcherry. Используя iPS в Брайтфилде, найдите координационный самолет и откройте бессмысленного менеджера.
Переместите сцену и используйте кнопку точек отметки, чтобы хранить координаты не менее 10 позиций, представляющих интерес. Переключитесь с iPS на монитор. Установите фокусную плоскость и нажмите кнопку заменить точку в бессмысленно менеджер для калибровки каждой точки.
Откройте экспериментальный конструктор и немаркированные болезни укладки коробки. Выберите соответствующие флуоресцентные каналы и оптимальные настройки устранения и установите интервалы между получением изображения и общим временем эксперимента. Включите фокусировку для выбранных позиций и выберите папку данных, в которой файлы изображений должны быть автоматически сохранены.
Перепроверьте все настройки в микроскопе управления программным обеспечением и начать промежуток времени эксперимента. После первого часа эксперимента убедитесь, что все позиции на сцене все еще находятся в фокусе. Когда эксперимент с промежуток времени будет закончен, удалите чашку Петри и отбросьте 35-миллиметровую тарелку с агарозной прокладкой в соответствии с соответствующими протоколами биобезопасности.
Для обработки данных изображений замедленного действия перенесите экспериментальные данные на компьютер, загруженный программным обеспечением Фиджи, и откройте изображение на Фиджи. В вариантах импорта биоформав выберите стек представления с гиперстахой. В составном цветовом режиме выберите автоматическую шкалу.
Прокручивая стеки изображений, оцените, оставались ли клетки и bdelloplasts фокусом в ходе эксперимента. Присутствуют ли зеленые флуоресцентные пятна из ДНК и mNeon green в клетках B.bacteriovorus внутри bdelloplasts на протяжении всей фазы роста и можно ли визуализировать все этапы хищного жизненного цикла. Для анализа конкретного B.bacteriovorus ячейки bdelloplast, использовать инструмент отбора, чтобы отметить ячейку интереса.
Затем дублируйте выбранный регион. В дублируется изображение, нажмите процесс и гладкой и для каждого флуоресцентного канала, нажмите изображение, цвет, каналы инструменты, и выбрать канал интереса. Затем нажмите на изображение, отрегулируйте и яркость контраста, чтобы настроить яркость и контрастность изображения в каждом канале.
Чтобы добавить планку масштаба, выберите анализ, инструменты и планку масштабирования. Чтобы добавить таймштамп к изображениям, щелкните изображения, стеки и штамповщик времени. Для сохранения измененных изображений выберите TIF.
Чтобы сохранить данные в качестве последовательности изображений, AVI для создания фильма, или PNG, чтобы сохранить одно изображение текущего кадра. Эта система микроскопии Time-Lapse Fluorescence позволяет в режиме реального времени отслеживать отдельные клетки B.bacteriovorus и предоставляет ценную информацию о каждом этапе сложного хищнического жизненного цикла. Синтез пилюльки mCherry позволяет маркировать всю хищную клетку в фазе нападения, а также на ранней стадии фазы роста.
Переход от атаки к репликациольной фазе может быть визуализирована не только образованием хозяина bdelloplast, но и появлением реплисомы. Реплиома собирается на полюсе вторгающейся клетки и более одной replisome можно наблюдать в растущей нити B.bacteriovorus по мере развития фазы размножения. После синтеза нескольких копий хромосомы репликация прекращается.
Наконец, многонуклеированная нить подвергается септации и потомства клетки высвобождаются из bdelloplast. Клетки B.bacteriovorus должны быть достаточно материальными, чтобы активно искать свою добычу, а плотность всей клетки должна быть достаточно высокой, чтобы позволить хищнической клеточной привязанности. Эта платформа может быть полезна в экспериментах с участием мультимедикаментозных устойчивых патогенов и для содействия улучшению генной инженерии B.bacteriovorus как живого антибиотика в человеческой и ветеринарной медицине.
