Canlı Hücreli Bdellovibrio bakteriovorus görüntüleme bu yırtıcı bakterilerin karmaşık yaşam döngüsü nedeniyle zor olmuştur. Protokolümüz, tüm yaşam döngüsünün aşamalarının gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak sağlar. Protokolümüz belirli bir eşitleme suşlarına dayanmasına rağmen, patojenik suşlar da dahil olmak üzere çeşitli bakteriyel suşlara kolayca adapte edilebilir.
Bir B.bacteriovorus kültürü kurmak için, bir mililitre taze 24 saatlik kültürbakterileri ile bir mililitre gecelik av kültürünün üç mililitresini içeren 250 mililitrelik bir şişede 50 mililitre kalsiyum hippi tamponu içeren bir araya getirin. Dakikada 30 derece ve dakikada 200 devirde 24 saatlik kuluçkadan sonra, av hücrelerinin sıvı monte edilmiş yüz kontrastlı mikroskopi ile tamamen lysed olup olmadığını kontrol edin. Çok sayıda çok atak fazlı B.bakteriovorus hücresi bulunmalı ve e.coli hücresi veya bdelloplast görünmemelidir.
B.bacteriovorus kültürünü 0,45 mikrometrelik gözenek boyutufiltresinden 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün ve bir santrifüjdeki filtrasyonu askıya alın. Daha sonra b.bakteriovorus peletini üç mililitre kalsiyum hippitamponu yla yaklaşık 0,2'nin 600 nanometresinde son optik yoğunluğa kadar askıya alın ve bakterileri 30 dakika boyunca dakikada 30 derece ve dakikada 200 devrimle kuluçkaya yatırın. Konak hücreleri hazırlamak için, ilgi ana suş tek bir koloni seçin ve 37 santigrat derece ve dakikada 180 devrimleri bir gecede kuluçka için gerekli olarak antibiyotik ile takviye YT orta 10 mililitre bakteri nodülate.
Ertesi sabah iki mililitrelik bir gece kültürünü iki mililitrelik bir test tüpüne aktarın ve hücreleri santrifüj le peletler. Sonra kalsiyum hippiler tampon 200 mikrolitre pelet yeniden askıya. Av hücresinin tek hücre düzeyinde ayrıldığından emin olmak için santrifüjden sonra tüm hücre peletinin tamamen askıya alınması çok önemlidir.
Zaman atlamalı floresan mikroskopi için hücreleri hazırlamak için, ilk olarak, kalsiyum hippiler tampon 20 mililitre ile düşük floresan moleküler sınıf agarose 200 miligram karıştırın ve bir mikrodalga agarose eritin. 35 milimetrelik bir cam alt çanağa erimiş agarose üç mililitre dökün ve agarose katılaşmak için izin. Bir laboratuvar mikro spatula kullanarak, dikkatle ped merkezi kutup rahatsız etmeden çanak agarose ped çıkarın ve bir Petri çanak kapağı üzerinde ped alt tarafı yerleştirin.
Odaklanmış ped üzerine konsantre konak hücre süspansiyon beş mikrolitre yerleştirin ve merkezi kutup hücreleri yaymak için bir aşılama döngü kullanın. Sonraki yayılmadan konak hücre kaplı yüzeye konsantre B.bacteriovorus süspansiyon beş mikrolitre ekleyin ve hızlı bir şekilde 35 mililitre cam alt çanak üst aşağı jel dönmek. Sonra bir kapak ile çanak kapağı.
Eş kültürün Lapse Floresan mikroskobu için, kabı petri kabıtutucuya yerleştirin, öyle ki çanak deney boyunca hareket etmeyecek ve ters mikroskop hedefine bir damla daldırma yağı ve kabın dibine bir damla yerleştirin. Tutucuyu ters mikroskop odasındaki mikroskop aşamasına monte edin ve mikroskop yazılımında büyütmeyi 100X'e, polikrom lensi de GFP ve Mcherry'ye ayarlayın. Brightfield'da bir iPS kullanarak odak düzlemini bulun ve anlamsız yöneticiyi açın.
Sahneyi taşıyın ve en az 10 pozisyonun koordinatlarını depolamak için işaret noktaları düğmesini kullanın. Kamera valini iPS'den monitöre geçirin. Odak düzlemini ayarlayın ve her noktayı kalibre etmek için anlamsız daki nokta değiştir düğmesini tıklatın.
Deney tasarımcısını açın ve hastalık istifleme kutusunu işaretleyin. Uygun floresan kanalları ve en uygun eleme ayarlarını seçin ve görüntü edinme ile denemenin toplam süresi arasındaki aralıkları ayarlayın. Seçilen konumlar için odak bakımını etkinleştirin ve görüntü dosyalarının otomatik olarak kaydedilmesi gereken veri klasörünü seçin.
Mikroskop yazılım denetimindeki tüm ayarları yeniden kontrol edin ve hızlandırılmış denemeyi başlatın. Denemenin ilk saatinden sonra, tüm sahne konumlarının hala odakta olup olmadığını kontrol edin. Zaman atlamalı deney tamamlandığında, Petri kabını çıkarın ve uygun biyo-güvenlik protokollerine göre 35 milimetrelik kabı bir agarose pedle atın.
Zaman atlamalı görüntü verilerinin işlenmesi için, deneysel verileri Fiji yazılımıyla yüklü bir bilgisayara aktarın ve Fiji'de bir görüntü açın. Biyo-formatalma seçeneklerinde, hyperstack'li görünüm yığınını seçin. Bileşik renk modunda otomatik ölçek seçin.
Görüntü yığınları arasında kaydırma yaparak hücrelerin ve bdelloplastların deney boyunca odak noktası olarak kalıp kalmadığı değerlendirilir. BÜYÜME evresi boyunca bdelloplastların içindeki B.bacteriovorus hücrelerinde DNA ve mNeon yeşilinden gelen yeşil floresan lekelerin bulunup bulunmadığı ve yırtıcı yaşam döngüsünün tüm aşamalarının görselleştirilip görüntülenilemeyeceği. Belirli bir B.bacteriovorus hücre bdelloplast analiz etmek için, ilgi hücre işaretlemek için bir seçim aracı kullanın.
Ardından seçilen bölgeyi çoğaltın. Yinelenen resimde, işlem ve pürüzsüz'e tıklayın ve her floresan kanal için görüntü, renk, kanal araçlarını tıklatın ve ilgi çekici kanalı seçin. Ardından, her kanaldaki görüntünün parlaklığını ve kontrastını ayarlamak için görüntü, ayarla ve parlaklık kontrastını tıklatın.
Ölçek çubuğu eklemek için çözümle, araçları ve ölçek çubuğu'nı seçin. Resimlere zaman damgası eklemek için resimlere, yığınlara ve zaman damgasına tıklayın. Değiştirilen görüntüleri kaydetmek için TIF'i seçin.
Verileri görüntü dizisi olarak kaydetmek için, bir film üretmek için AVI veya geçerli çerçevenin tek bir görüntüsünü kaydetmek için PNG. Bu Hızlandırılmış Floresan mikroskopisi tabanlı sistem, b.bacteriovorus hücrelerinin gerçek zamanlı takibini sağlar ve karmaşık yırtıcı yaşam döngüsünün her aşaması hakkında değerli bilgiler sağlar. Pillsy mCherry füzyon tüm yırtıcı hücre saldırı aşamasında yanı sıra büyüme aşamasının erken aşamasında etiketli olmasını sağlar.
Saldırıdan çoğaltıcı faza geçiş sadece konak bdelloplast oluşumu ile değil, aynı zamanda replisome görünümü ile görüntülenebilir. Replisome istilacı hücre direğinde toplanır ve üreme evresi ilerledikçe büyüyen B.bacteriovorus filamenti içinde birden fazla replisome görülebilir. Kromozomun birkaç kopyası sentezedildikten sonra, çoğaltıcı sonlandırılır.
Son olarak, multinükleli filament septasyon geçmesi ve döl hücreleri bdelloplast serbest bırakılır. B.bakteriovorus hücreleri avlarını aktif olarak arayacak kadar malzemeli olmalı ve tüm hücre yoğunluğu yırtıcı hücre bağlanmasına izin verecek kadar yüksek olmalıdır. Bu platform, çoklu ilaca dirençli patojenleri içeren deneylerde yararlı olabilir ve insan ve veterinerlikte canlı antibiyotik olarak B.bacteriovorus'un genetik mühendisliğindeki gelişmeleri kolaylaştırmak için yararlı olabilir.
