وقد حية الخلية Bdellovibrio bacteriovorus التصوير تحديا بسبب دورة الحياة المعقدة لهذه البكتيريا المفترسة. بروتوكولنا يسمح بمراقبة مراحل دورة الحياة الكاملة في الوقت الحقيقي. على الرغم من أن بروتوكولنا يستند إلى سلالات معادلة محددة ، إلا أنه قد يكون من السهل تكييفه مع مجموعة متنوعة من السلالات البكتيرية بما في ذلك السلالات المسببة للأمراض.
لإقامة ثقافة B.bacteriovorus، الجمع بين ملليلتر واحد من البكتيريا الطازجة على مدار 24 ساعة مع ثلاثة ملليلتر من ثقافة فريسة بين عشية وضحاها في قارورة 250 ملليلتر تحتوي على 50 ملليلتر من العازلة الهيبيوم الكالسيوم تكملها المضادات الحيوية حسب الحاجة. بعد حضانة 24 ساعة في 30 درجة مئوية و 200 الثورات في الدقيقة الواحدة، تحقق من أن الخلايا الفريسة قد تم lysed تماما من قبل السائل محمولة على الوجه المجهر التباين. العديد من الخلايا B.bacteriovorus متعددة التهجمات يجب أن تكون موجودة ولا يجب أن تكون خلية الإشريكية القولونية أو bdelloplast مرئية.
سلالة ثقافة B.bacteriovorus من خلال مرشح حجم المسام ميكرومتر 0.45 في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر وتعليق أسفل الترشيح في جهاز طرد مركزي. ثم إعادة تعليق بيليه B.bacteriovorus في ثلاثة ملليلتر من الهيبيوم الكالسيوم العازلة إلى كثافة بصرية نهائية في 600 نانومتر من حوالي 0.2 واحتضان البكتيريا في 30 درجة مئوية و 200 الثورات في الدقيقة الواحدة لمدة 30 دقيقة. لإعداد الخلايا المضيفة، حدد مستعمرة واحدة من سلالة المضيف من الفائدة و nodulate البكتيريا في 10 ملليلتر من YT المتوسطة تكملها المضادات الحيوية حسب الضرورة لاحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 180 الثورات في الدقيقة الواحدة.
في صباح اليوم التالي نقل مليلتر من ثقافة بين عشية وضحاها إلى أنبوب اختبار ملليلتر و بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ثم إعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولترات من الكالسيوم hippies العازلة. من المهم جداً إعادة تعليق الخلية بالكامل بعد الطرد المركزي للتأكد من أن يتم فصل خلية الفريسة على مستوى الخلية المفردة.
لإعداد الخلايا للتنظير المنظاري الفلوري الفاصل زمنيًا ، أولاً ، قم بخلط 200 ملليغرام من الفلورسنت المنخفضة من الدرجة الجزيئية agarose مع 20 ملليلترًا من عازلة الهيبيوم الكالسيوم وحل الأعواروز في الميكروويف. صب ثلاثة ملليلتر من agarose ذاب في طبق القاع الزجاج 35 ملليمتر والسماح agarose لترسيخ. باستخدام ملعقة صغيرة مختبر، وإزالة بعناية وسادة agarose من الطبق دون إزعاج القطب مركز لوحة ووضع الجانب السفلي لوحة حتى على غطاء طبق بيتري.
ضع خمسة ميكرولترات من تعليق الخلية المضيفة المركزة على الوسادة المنقلبة واستخدم حلقة تطعيم لنشر الخلايا في القطب الأوسط. التالي إضافة خمسة microliters من تعليق B.bacteriovorus المركزة على السطح المغلف الخلية المضيفة دون أن تنتشر والعودة بسرعة هلام إلى 35 ملليلتر الزجاج أسفل الطبق الجانب العلوي إلى أسفل. ثم غطي الطبق بغطاء.
لعصر الفاصلة مجهرية من الثقافة المشتركة، ضع الطبق في حامل طبق بيتري بحيث لن يتحرك الطبق على مدار التجربة ووضع قطرة واحدة من زيت الغمر على هدف المجهر المقلوب وإسقاطة واحدة على الجزء السفلي من الطبق. جبل حامل على مرحلة المجهر داخل غرفة المجهر المقلوب وفي برنامج المجهر تعيين التكبير إلى 100X وعدسة متعددة الألوان إلى GFP و Mcherry. باستخدام iPS في برايتفيلد، حدد موقع الطائرة البؤرية وفتح المدير الذي لا طائل منه.
حرك المرحلة واستخدم زر نقاط العلامة لتخزين إحداثيات 10 مواقع على الأقل ذات أهمية. قم بتبديل الكاميرا من شاشة iPS إلى الشاشة. تعيين المستوى البؤري وانقر فوق زر استبدال نقطة في لا طائل للمدير لمعايرة كل نقطة.
افتح مصمم التجربة وصندوق تجميع الأمراض غير المركّب. حدد القنوات الفلورية المناسبة وإعدادات الاستبعاد الأمثل، وقم بتعيين الفواصل الزمنية بين الحصول على الصورة والوقت الإجمالي للتجربة. تمكين صيانة التركيز البؤري للمواقع المختارة وتحديد مجلد البيانات الذي يجب حفظ ملفات الصور فيه تلقائيًا.
إعادة فحص كافة الإعدادات في التحكم في برنامج المجهر وبدء تجربة الفاصل الزمني. بعد الساعة الأولى من التجربة، تحقق من أن جميع مواضع المرحلة لا تزال في التركيز. عند الانتهاء من تجربة الفاصل الزمني، قم بإزالة طبق بيتري وتجاهل الطبق الذي يبلغ 35 ملليمترًا مع وسادة agarose وفقًا لبروتوكولات السلامة الحيوية المناسبة.
لمعالجة بيانات الصور الفاصلة زمنياً، قم بنقل البيانات التجريبية إلى حاسوب محمل ببرمجيات فيجي وفتح صورة في فيجي. في خيارات الاستيراد تنسيقات حيوية، حدد عرض المكدس مع هايبركاكس. في وضع اللون المركب، حدد المقياس التلقائي.
عن طريق التمرير من خلال كومة الصورة تقييم ما إذا كانت الخلايا وbdelloplasts ظلت التركيز على مدى التجربة. ما إذا كانت البقع الفلورية الخضراء من الحمض النووي والأخضر mNeon موجودة داخل خلايا B.bacteriovorus داخل bdelloplasts طوال مرحلة النمو وما إذا كان يمكن تصور جميع مراحل دورة حياة المفترسة. لتحليل bdelloplast الخلية B.bacteriovorus معينة، استخدم أداة اختيار لوضع علامة على الخلية من الفائدة.
ثم قم بتكرار المنطقة المختارة. في الصورة المكررة، انقر فوق العملية وسلاسة ولكل قناة من قنوات الفلورسنت، انقر فوق الصورة، اللون، أدوات القنوات، وحدد القناة ذات الأهمية. ثم انقر على الصورة، وضبط، وتباين السطوع لضبط سطوع وتباين الصورة في كل قناة.
لإضافة شريط مقياس، حدد تحليل، وأدوات، وشريط مقياس. لإضافة طابع زمني إلى الصور، انقر فوق الصور، والمكدسات، والطوابع الزمنية. لحفظ الصور المعدلة، حدد TIF.
لحفظ البيانات كتسلسل صورة، AVI لإنتاج فيلم، أو PNG لحفظ صورة واحدة للإطار الحالي. هذا الوقت الفاصل الفلوريسنس نظام يستند المجهر يسمح لتتبع في الوقت الحقيقي من خلايا B.bacteriovorus الفردية ويوفر معلومات قيمة حول كل مرحلة من دورة حياة المفترسة المعقدة. يتيح الانصهار mCherry بحبوب الخلية المفترسة بأكملها أن تكون وصفت في مرحلة الهجوم وكذلك في مرحلة مبكرة من مرحلة النمو.
يمكن تصور الانتقال من الهجوم إلى مرحلة النسخ المتماثل ليس فقط من قبل تشكيل bdelloplast المضيف ولكن أيضا من خلال ظهور replisome. يتم تجميع replisome في القطب الخلية الغازية ويمكن ملاحظة أكثر من replisome داخل خيوط B.bacteriovorus المتنامية مع تقدم مرحلة التكاثر. بعد أن يتم توليف عدة نسخ من الكروموسوم، يتم إنهاء النسخ المتماثل.
وأخيراً، تخضع خيوط الخيوط المتعددة النوى للخيط ويتم تحرير الخلايا النسلية من البلاست. يجب أن تكون خلايا B.bacteriovorus مادية بما يكفي للبحث بنشاط عن فريستها ويجب أن تكون كثافة الخلايا بأكملها عالية بما يكفي للسماح بتعلق الخلايا المفترسة. قد تكون هذه المنصة مفيدة في التجارب التي تشمل مسببات الأمراض المقاومة للأدوية المتعددة وتسهيل التحسينات في الهندسة الوراثية للبكتيريا B.bacteriovorus كمضاد حيوي حي في الطب البشري والطب البيطري.
