Это видео вводит быстрый и эффективный метод синтеза магнитных наночастиц и использования магнитометрии для фотографирования трансформации в биологической среде. Магнитные наночастицы привлекли повышенное внимание к биомедицинским приложениям, и важно понимать, что судьба когда-то усвоилась в клетках. Это достигается здесь путем измерения клеточного магнетизма.
Как для синтеза магнитных наночастиц, так и для измерений, результат может быть затронут загрязнением. Используйте хорошо очищенные химические флаконы и убедитесь, что оборудование магнитометра свободно от загрязнения. Держатель образцов магнитометрии обычно используется для образцов порошка.
Мы показываем, как адаптировать использование держателя к жидким или биологическим образцам. В 30 миллилитровой мане волновой стеклянный флакон растворяет 400 миллиграммов железа три ацетилацетоната в 10 миллилитров бензилового спирта. Используя микроволновый реактор, нагревайте подвеску от 25 градусов по Цельсию до 250 градусов по Цельсию со скоростью 11,25 градуса по Цельсию в минуту и поддерживайте ее на уровне 250 градусов по Цельсию.
Чтобы отделить наночастицы, нанесите магнит неодимия в течение 30 минут. Чтобы гранулы наночастиц, выполнить серию моет с помощью 10 миллилитров назначенной жидкости мытья и применения магнита неодимия в течение пяти минут. Снимите фильтрат и добавьте 12 миллилитров по 10 к минус двум молярным соляным кислотам.
Центрифуга подвески и 100 килодальтонный фильтр при 2200 раз G в течение 10 минут. Затем повторное использование наночастиц в 10 миллилитров от 10 до минус двух молярных соляной кислоты. Подготовь решение молекулы покрытия, как описано в рукописи.
Добавьте 10 миллилитров наночастиц к раствору молекулы покрытия при соотношении массы пять к одному между молекулами покрытия и наночастицами. Затем агитировать смесь в течение двух часов при комнатной температуре с помощью магнитного мешалки. После завершения реакции отрегулируйте рН смеси до семи с использованием одного гидроксида натрия.
Когда культура мезенхимальных стволовых клеток человека находится на проходе 5 и 90% стечения, удалить средний и промыть клетки сыворотки без RPMI без глутамина. К каждой 150 квадратных сантиметров культуры колбы, добавить 10 миллилитров наночастиц подвески. Инкубировать колбы при 37 градусах цельсия и 5%углекислого газа в течение 30 минут.
Затем отбросьте среду, содержащую суспензию наночастиц, и вымойте клетки один раз с помощью безотхвки RPMI 1640. Добавить DMEM дополнен 10%FBS и 1%пенициллин стрептомицин. Инкубация на ночь при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе, чтобы обеспечить полную интернализацию наночастиц.
Добавьте 10 миллилитров 0,05%трипсина EDTA, предварительно разоперированного для 37 градусов по Цельсию, к каждой колбе магнитно помеченных MSCs. Через две-три минуты, когда клетки отсоединяются, немедленно инактивировать трипсин, добавив одну треть объема заранее предупрежденных дополненных DMEM. Центрифуга отдельных клеток в 260 раз G в течение пяти минут.
Аспирировать среду и повторно изымать клетки в небольшом объеме клеточной сфероидной культуры среды при концентрации около 200 000 клеток на 50 микролитров. Добавьте один миллилитр свежеприготовленной клеточной сфероидной культуры к 15-миллилитровой стерильной конической центрифуге. Затем добавьте объем клеточной подвески, соответствующий 200 000 ячеек.
Центрифуга эти магнитно помеченные клетки на 180 раз G в течение трех минут для того, чтобы сформировать ячейку гранулы в нижней части трубки. Затем поместите трубку в инкубатор при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе, сохраняя крышку слегка открытой для газозамена. Поместите либо данный объем магнитной наночастицы, либо фиксированную одноклеточную суспензию в вибрирующий образец магнитометра, либо VSM, держатель образца.
При необходимости ленту PTFE можно использовать для предотвращения утечки. Вставьте держатель образца в VSM и сканируйте для смещения образца. Поместите образец в положение, соответствующее максимуму намагничения.
Выполните первое измерение на низком магнитном поле между отрицательными 1500 Oersteds и положительными 1500 Oersteds со скоростью 20 Oersteds в секунду. Выполните второе измерение на высоком магнитном поле между нулевыми Oersteds и положительными 30,000 Oersteds со скоростью 200 Oersteds в секунду. 10 микролитров наночастиц, рассеянных в аквеозном растворе, были измерены в вибрирующем образце магнитометра.
Наклон второй части кривой представляет собой диамагнитную константу, представляющую диамагнитный сигнал от воды и держателя образца. Эта диамагнитная константа была вычтена из магнитного момента раствора, чтобы получить только магнитный момент наночастиц. Затем был определен магнитный момент насыщения.
Покрытые наночастицами были интернализированы в стволовых клетках. На снимках электронного микроскопа показаны наночастицы с покрытием цитратов и ПАА, ограниченные эндосомами. После того, как клетки были гранулированы центрифугой, они образовали клеточный сфероид, который может храниться в культуре в течение длительных периодов времени.
Отдельные клеточные сфероиды также измерялись с помощью VSM, и магнитный момент насыщения использовался для расчета количества наночастиц в клеточном образце. Было установлено, что поглощение наночастиц зависит от их концентрации инкубации. Снижение магнетизма клеточных сфероидов с течением времени указывает на биодеградацию наночастиц, что было подтверждено электронной микроскопией.
Деградация была более существенной в наночастицах с цитратным покрытием, чем в наночастицах с покрытием ПАА. Используя магнитометрию, деградация магнитных наночастиц в клетках может быть точно количественно, и влияние фьючерсов наночастиц на заинтересованных в сыром поведении может быть оценено. В этом протоколе измерения магнитометрии проводились на клеточных сфероидах, но они могут быть распространены на клетки в подвеску или на органы.
С описанным методом, вы можете исследовать взаимодействия недавно разработанных магнитных наночастиц в различных клеточных систем интересов, но и вы можете следить за их in vivo биораспределения и судьбы.
