Этот протокол дает точное, пошаговое руководство для литья легочной артериальной сосуда как у взрослых, так и у ранних постнатальных мышей. Этот метод позволяет пользователям полностью отливки всей сосудистой сети для визуализации различными методами, в том числе микро-КТ, сохраняя при этом целостность мягких тканей. Этот метод особенно полезен для поиска легочно-сосудистой морфологии и архитектуры, но может быть легко адаптирован для ориентации других сосудистых коек.
Как и многие операции и вскрытия, нет никакой замены для фактической визуализации процедуры, и зрители могут извлечь выгоду из того, что некоторые из наиболее сложных маневров выполняются. После того, как процесс xiphoid подвергается, осторожно схватить и поднять грудную клетку. Аккуратно сделайте разрез в ныне открытой, полупрозрачной диафрагме.
Легкие заметно рухнут и отойди от диафрагмы. После разоблачения легких и трахеи, нить 15 сантиметров PE10 трубки на концентратор 30-го калибра иглы. И прикрепите это устройство к одноми миллилитровому шприцу, содержащем от 10 до 4 мла нитропрузида натрия, в PBS.
Заранее поршень премьер трубки, пока весь воздух был очищен. В качестве эффективной альтернативы тексту, проникнуть на вершину сердца, с одной стороны, и передать кончики изогнутых типсов через мышцы, и с другой стороны ткани. Возьмитесь за один конец 10-сантиметровой длины 7-0 шелка и потяните через ткань около двух сантиметров.
После связывания с шва, использовать оставшиеся восемь сантиметров шва, чтобы вытащить сердце caudally. И заклеить конец шва на хирургическую доску. Крюк кончики изогнутых типсов как под восходящей аорты и легочной артерии ствола.
И потяните три сантиметра длиной 7-0 шелка обратно через отверстие, чтобы создать один бросок свободный шов. Используйте ножницы, чтобы сделать один-два миллиметра разрез к вершине сердца, проникая в тонкостенный правый желудочек. И ввести загрунтованное трубки в правый желудочек, мягко продвигая катетер в полупрозрачный, тонкостенный ствол легочной артерии.
Визуально убедитесь, что катетер не продвинулся ни в левую, ни в правую легочные ветви, и не примыкает к точке ветви легочной артерии. Лента дистальной части трубки на хирургическую доску, и осторожно затянуть свободный шов вокруг обоих больших сосудов. Вырежьте восьмисемейный кусок шва, чтобы вернуть сердце в естественное положение покоя.
И клип левый оракул сердца, чтобы перфусат выйти из сосудов. Затем используйте шприц-насос, чтобы наполнить нитропрузсид натрия со скоростью потока 0,5 мл/мин, чтобы как промыть кровь, так и максимально расширить сосуды, пока перфузат не прояснится. Чтобы построить блок инфляции легких, вырезать гибкий пластиковый 24-го калибра внутривенного катетера из ванны и подключиться к игле инфузии набор бабочки.
Прикрепите этот блок к стоп-коку и прикрепите стопкок к открытому 50-миллилитровому шприцу. После загрузки шприца с формалином и грунтовки катетера, с стопкок закрыт, положение шприц в кольцо стенд, до точки, в которой мениск 20 сантиметров выше трахеи. Поместите два свободных шва, два-четыре миллиметра друг от друга, уступая крикоидного хряща, и использовать ножницы, чтобы сделать небольшой разрез в cricothyroid связки, превосходит швы.
Вставьте катетер в отверстие, и заранее кончик за два свободных швов. Затяните швы вокруг трахеи, и открыть стопкок, чтобы формалин войти в легкие под действием силы тяжести. Подождите пять минут, пока легкие полностью надуваются.
Если легкие придерживаются грудной клетки во время инфляции, используйте тупые типсы, чтобы схватить внешнюю сторону грудной клетки, и переместить ребра во всех направлениях, чтобы помочь в освобождении долей, не внося прямого контакта с легкими. Через пять минут, втягивать катетер за первый шов и ligate. Затем втягивайте катетер за второй шов и лигат.
Легкие теперь должны быть надуты в закрытом, под давлением состоянии. Чтобы отбросить сосуд, загрузите один миллилитр раствора полимерного разбомбительного средства 8-1-1 в одномиллилитровый шприц. И аккуратно вставьте поршень.
С помощью перевернутого шприца, угнетайте поршень, чтобы удалить воздух, и чтобы образование мениска на кончике шприца. Удалите нитропрузийный шприц натрия из концентратора иглы, и капельное добавление PBS в концентратор, чтобы создать мениска. Присоединиться к полимерно-составной шприц к концентратору, и начать вливание на 0,02 миллиметра в минуту.
Мониторинг соединения, как он свободно перемещается через трубки, унося объем шприца, как он входит в ствол легочной артерии. Продолжайте изобилие до тех пор, пока все доли полностью заполнены, вплоть до малейшего сосуда. Остановите насос и еще раз обратите внимание на объем шприца.
Обложка легких с волоконно-оптической очистки протрите, и либерально применять PBS. Разрешить образцу сидеть спокойно в течение 30 до 40 минут при комнатной температуре. После того, как полимер соединения вылечить и затвердеть, разорвать конечностей и нижней половины мыши.
И поместите голову и грудную клетку в 50-миллилитровый конический заполнены 10%buffered формалин, в одночасье. На следующее утро схватите трахею, чтобы аккуратно отделить сердце и легкий блок от оставшейся грудной клетки и грудной клетки. Поместите блок собранных тканей в заполненный формалином флакон сцинтилляции.
Успешный бросок приведет к равномерному наполнению всей легочной артериальной сети. Если есть повреждения легких или легких дыхательных путей, небольшие утечки будут препятствовать легких от проведения давления. Неоднородная или неполная начинка может возникнуть из шлюза в результате введения воздуха в сосудистую систему через катетер, блокируя нисходящий поток соединения.
Недозаполнение происходит, когда слишком мало соединения вводится в сосуды. Кроме того, переполнирование, или введение слишком много полимерного соединения слишком быстро, может привести к разрыву артерий, или, чаще всего, венозный транзит. Продвижение катетера слишком далеко вниз по стволу легких может привести к кончик клин в одну легочную артерию ветви, создавая дисбаланс в потоке, и в результате чего одна сторона, чтобы заполнить быстрее, чем другие.
Тщательная производительность техники, как попродемонстрировано, с использованием соответствующего прямого мониторинга дистальной сосудоуполносяжной конечной точки, а также стандартные показатели инфузии могут привести к оптимальному наполнению легочной сосудов. Кроме того, адаптация этого метода к системной сосудоурядке может дать не менее благоприятные результаты в других сосудистых койках. После литья образцы могут быть обработаны для микро-компьютерного томографии сканирования.
Для постобработки коммерческий пакет программного обеспечения может быть использован для создания 3D-рендеринга объема легочно-сосудистого дерева. При попытке этой техники в первый раз, будьте особенно осторожны вокруг хрупких легких и легочной артерии. Самое главное, избегать введения воздуха в сосудистой цепи.
После успешного литого, образец может быть отсканирован с помощью микро-КТ, и вопросы, связанные с сосудистой морфометрии и архитектуры могут быть изучены.
