Este protocolo proporciona una guía precisa paso a paso para la fundición de la vasculatura arterial pulmonar en ratones postnatales adultos y tempranos. Esta técnica permite a los usuarios lanzar completamente toda la red vascular para su visualización mediante una variedad de métodos, incluyendo micro-CT, manteniendo al mismo tiempo la integridad de los tejidos blandos. Esta técnica es particularmente útil para examinar la morfología y la arquitectura pulmonar-vascular, pero se puede adaptar fácilmente para la focalización de otras camas vasculares.
Al igual que muchas cirugías y disecciones, no hay sustituto para visualizar realmente un procedimiento, y los espectadores pueden beneficiarse de ver algunas de las maniobras más desafiantes que se están realizando. Una vez expuesto el proceso de xifoide, agarre y eleve suavemente la caja torácica. Haga cuidadosamente una incisión en el diafragma semitransparente ahora expuesto.
Los pulmones colapsarán visiblemente y se alejarán del diafragma. Después de exponer el pulmón y la tráquea, enhebra 15 centímetros de tubo de PE10 en el cubo de una aguja de calibre 30. Y conecte esta unidad a una jeringa de un mililitro, que contenga 10 al molar 4 de nitroprusido sódico, en PBS.
Avance el émbolo para preparar el tubo hasta que todo el aire haya sido purgado. Como alternativa eficaz al texto, penetra el ápice del corazón en un lado, y pasa las puntas de los fórceps curvos a través del músculo, y hacia fuera el otro lado del tejido. Sujete un extremo de una longitud de 10 centímetros de seda de 7-0 y tire de aproximadamente dos centímetros a través del tejido.
Después de atar la sutura, utilice los ocho centímetros restantes de sutura para tirar del corazón caudalmente. Y pegue el extremo de la sutura a la placa quirúrgica. Enganche las puntas de los fórceps curvos bajo la aorta ascendente y el tronco de la arteria pulmonar.
Y tire de una longitud de tres centímetros de 7-0 de la seda hacia atrás a través de la abertura para crear una sutura suelta de un solo tiro. Usa tijeras para hacer una incisión de uno a dos milímetros hacia el ápice del corazón, penetrando en el ventrículo derecho de paredes delgadas. E introducir el tubo cebado en el ventrículo derecho, avanzando suavemente el catéter en el tronco de la arteria pulmonar semitransparente, de paredes delgadas.
Verifique visualmente que el catéter no ha avanzado hacia las ramas pulmonares izquierda o derecha, y no se encuentra con el punto de rama de la arteria pulmonar. Pegue la parte distal del tubo en la placa quirúrgica y apriete suavemente la sutura suelta alrededor de ambos vasos grandes. Corte la pieza de sutura de ocho centímetros para devolver el corazón a una posición de reposo natural.
Y corta el oráculo izquierdo del corazón para permitir que el perfuto salga de la vasculatura. A continuación, utilice una bomba de jeringa, para infundir nitroprusido de sodio a un caudal de 0,5 ml/min para vaciar la sangre, y para dilatar al máximo la vasculatura, hasta que la perfusión se despeje. Para construir la unidad de inflado pulmonar, corte el catéter intravenoso de plástico flexible de calibre 24 de una bañera y conéctelo a la aguja de un conjunto de infusión de mariposas.
Fije esta unidad a la llave y conecte el llave de tope a una jeringa abierta de 50 mililitros. Después de cargar la jeringa con formalina y cebar el catéter, con el llavero cerrado, coloque la jeringa en un soporte de anillo, hasta el punto en el que el menisco esté 20 centímetros por encima de la tráquea. Coloque dos suturas sueltas, de dos a cuatro milímetros de distancia, inferiores al cartílago cricoide, y use tijeras para hacer una pequeña incisión en el ligamento cricotiroido, superior a las suturas.
Inserte el catéter en la abertura y avance la punta más allá de las dos suturas sueltas. Apriete las suturas alrededor de la tráquea, y abra el llave para permitir que el formol entre en los pulmones por gravedad. Espere cinco minutos para que los pulmones se inflan por completo.
Si los pulmones se adhieren a la caja torácica durante la inflación, utilice fórceps con puntas contundentes para agarrar el exterior de la caja torácica, y mueva las costillas en todas las direcciones para ayudar a liberar los lóbulos sin hacer contacto directo con los pulmones. Después de cinco minutos, retraiga el catéter detrás de la primera sutura y ligato. Luego retraiga el catéter detrás de la segunda sutura y ligate.
Los pulmones ahora deben inflarse en un estado cerrado y presurizado. Para fundir la vasculatura, cargue un mililitro de una solución 8-1-1 de agente de curado diluyente de polímero en una jeringa de un mililitro. E inserte cuidadosamente el émbolo.
Con la jeringa invertida, presione el émbolo para extraer el aire y para permitir la formación de un menisco en la punta de la jeringa. Retire la jeringa de nitroprusido sódico del cubo de la aguja, y la adición de goteo PBS en el cubo, para crear un menisco. Une la jeringa compuesta por polímero al cubo e inicia la perfusión a 0,02 milímetros por minuto.
Supervise el compuesto a medida que se mueve libremente a través del tubo, observando el volumen de la jeringa a medida que entra en el tronco de la arteria pulmonar. Continúe la profusión hasta que todos los lóbulos estén completamente llenos, hasta el vaso más pequeño. Detenga la bomba y, una vez más, observe el volumen de la jeringa.
Cubra los pulmones con una toallita limpiadora de fibra óptica y aplique liberalmente PBS. Deje que la muestra se siente intacta durante 30 a 40 minutos a temperatura ambiente. Una vez que el compuesto del polímero se cura y endurece, cortar las extremidades y la mitad inferior del ratón.
Y coloque la cabeza y el tórax en una formalina cónica llena de 50 mililitros 10%, durante la noche. A la mañana siguiente, agarre la tráquea para separar suavemente el corazón y la unidad pulmonar de la caja torácica y el tórax restantes. Coloque el bloque de tejido cosechado en un vial de centelleo lleno de formalina.
Un molde exitoso resultará en un llenado uniforme de toda la red arterial pulmonar. Si hay daño en las vías respiratorias pulmonares o pulmonares, pequeñas fugas evitarán que los pulmones mantengan presión. El llenado irregular o incompleto puede surgir de una esclusa de aire como resultado de la introducción de aire en el sistema vascular a través del catéter, bloqueando el flujo aguas abajo del compuesto.
El relleno se produce cuando se introduce muy poco compuesto en la vasculatura. Alternativamente, el sobrellenado, o la introducción de demasiado compuesto de polímero demasiado rápido, puede causar ruptura arterial, o, más comúnmente, tránsito venoso. Avanzar demasiado por el tronco pulmonar puede hacer que la punta se a cuña en una rama de la arteria pulmonar, creando un desequilibrio en el flujo, y haciendo que un lado se llene más rápido que el otro.
El rendimiento cuidadoso de la técnica como se ha demostrado, utilizando el control directo adecuado de los puntos finales de la vasculatura distal, y las tasas de perfusión estándar pueden resultar en un llenado óptimo de la vasculatura pulmonar. Además, la adaptación de esta técnica a la vasculatura sistémica puede producir resultados igualmente favorables en otros lechos vasculares. Después de la fundición, las muestras se pueden procesar para la exploración de tomografía microcalculcó.
Para el postprocesamiento, se puede utilizar un paquete de software comercial para generar una representación de volumen 3D del árbol pulmonar-vascular. Al intentar esta técnica por primera vez, tenga especial cuidado alrededor de los pulmones frágiles, y la arteria pulmonar. Lo más importante, evitar introducir aire en el circuito vascular.
Después de un molde exitoso, una muestra puede ser escaneada por micro-CT, y se pueden explorar preguntas relacionadas con la morfometría vascular y la arquitectura.
