Биомедицинские исследования сталкиваются с кризисом воспроизводимости, поскольку новые результаты исследований редко переводятся в терапевтические приложения. Этот протокол снижает человеческий фактор и внедряет автоматизацию и стандартизацию в производство. Этот метод фокусируется конкретно на фотосшиваемых гидрогелях для применения в 3D-клеточных культурах, поскольку гидрогели стали наиболее используемой платформой в моделях рака и других тканей заболеваний в течение последнего десятилетия.
Мы успешно устранили текущие аппаратные и программные ограничения с помощью разработки технологической платформы с открытым исходным кодом. Эта платформа была специально разработана для гидрогелей и позволяет автоматизировать производственные процессы для исследований тканевой инженерии. Чтобы установить API, откройте интерфейс командной строки.
Чтобы установить рабочий API, введите pip install openworkstation и нажмите Enter. Чтобы управлять модулем пипетирования биопроизводства, введите команду для установки API opentrons. Затем с помощью командной строки откройте скрипт Python и проверьте, успешно ли установлены оба API.
Чтобы создать код протокола, откройте приложение разработки протокола, чтобы создать настраиваемый сценарий протокола, который будет выполняться платформой. Интерфейс работает на каждом часто используемом интернет-браузере. Введите имя протокола на странице установки и нажмите кнопку Продолжить.
В настройках входного лотка выберите блок нагрева три на четыре, чтобы определить входной лоток. Чтобы определить материалы и концентрации запасов, выберите Gel 1 в меню определения входов и введите GelMA в качестве имени. Установите концентрацию запаса на 20%, а количество образцов на три и нажмите кнопку Добавить, чтобы сохранить записи и заполнить первый столбец.
Выберите Gel 2 в меню определения входов и введите Alginate в качестве имени. Установите концентрацию запаса на 4%, а количество образцов на три и нажмите кнопку Добавить, чтобы сохранить записи и заполнить второй столбец. После установки параметров фотоинициатора и разбавителя, как показано, выберите сшивание фотографий, установите время 30 секунд, а интенсивность на два и нажмите ok. Затем установите тип плиты скважины на плиту 96 и нажмите Группа 1, чтобы можно было указать параметры для создания гидрогелей двойной сети.
Затем установите флажок При необходимости применить расширенный протокол смешивания, установите число образцов равным 96 и нажмите кнопку Продолжить. Чтобы задать расположение колоды, выберите подходящий тип лотка для каждого слота. Когда все типы лотков будут выбраны, щелкните левое поле пипетки и выберите в раскрывающемся меню положительное смещение от 10 до 100 микролитров.
Установите скорость аспирации на 600 и скорость дозирования на 800. Затем установите правильные параметры пипетки таким же образом. Затем щелкните Создать протокол, чтобы создать и сохранить сценарий протокола.
Перед выполнением протокола распылите расходные материалы с 70% этанолом и расположите их в соответствии с настройкой, определенной в пользовательской настройке. Поместите реакционные трубки с материалами в алюминиевый блок на температурные доки в соответствии с выбранной установкой. Затем распылите перчатки с 70% этанолом и осторожно откройте реакционные трубки, не касаясь открытых трубок.
Когда вещества достигнут соответствующей экспериментальной температуры, запустите сгенерированный протокол с помощью пользовательского интерфейса. Рабочая станция начнется с процесса самонаведения, за которым последует получение пустой колодезной пластины из модуля хранения. После снятия крышки с плиты скважины пластина транспортируется к следующему модулю.
Протокол определяет объем, который пипетируется из каждого складского раствора, и автоматически изменяет наконечники после каждого материала, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение. Чтобы смешивать вязкие растворы воспроизводимым способом, рабочая станция выполняет специальный протокол смешивания, который был оптимизирован для вязких гидрогелей. Приложение для проектирования протокола учитывает уровень заполнения резервуара и автоматически адаптирует высоту смешивания, чтобы предотвратить ненужное погружение в вязкие материалы.
После автоматической генерации 3D-моделей и плит скважин рабочая станция снова закрывает плиту скважины крышкой и сохраняет пластину скважины в запрограммированном положении в модуле хранения. Как только протокол будет завершен, извлеките пластину из модуля хранения. Для валидации и верификации проведенного протокола загрузите пластину на спектрофотометр и дважды считывайте поглощение на 450 нанометров.
После сохранения значений поглощения откройте файл электронной таблицы анализа, который предоставляется в качестве дополнительного материала в публикации, и скопируйте показания поглощения в таблицу в необработанном техническом паспорте. Затем нажмите на лист анализа, чтобы просмотреть средние значения, стандартное отклонение и коэффициент дисперсионных значений, которые автоматически рассчитываются и отображаются для равномерного распределения выборки для определенных строк и для конкретных столбцов 96-луночной пластины. Чтобы найти установку, которая обеспечивает высокую воспроизводимость глицериновых растворов, были созданы протоколы без контроля температуры и без касания наконечника, с контролем температуры и без касания наконечника, или с контролем температуры и с прикосновением наконечника.
Рассчитанный коэффициент вариационных значений для трех установок выявил значительное влияние температурной док-станции и сенсорной функции наконечника, подчеркнув способность протокола генерировать высоковоспроизводимые результаты при использовании обеих функций. Используя функцию сенсорного наконечника с температурной док-станцией, стандартное отклонение было значительно уменьшено в установке три. Построение графиков поглощения образца для установки три не дало никаких увеличивающихся или уменьшающихся значений на протяжении всего эксперимента и, следовательно, не показало влияния положения образца на значения поглощения.
Затем готовили серию разбавления GelMA путем разбавления 20%-ного раствора GelMA и оценки различий между различными разведениями GelMA. Величина поглощения, измеренная на каждой стадии концентрации, была значительно различной, и линейная регрессия продемонстрировала высокую припадность, подтверждающую способность генерировать различные стадии концентрации. Кроме того, влияние касания наконечника оценивалось для гидрогелей с двойной сетью с 5% GelMA, 2% альгинатом и 0,15% LAP, которые автоматически генерировались с установкой.
Интеграция сенсорного наконечника приводит к значительному снижению стандартного отклонения, поддерживающего генерацию воспроизводимого набора данных. Визуализация значений поглощения и тепловых карт подтвердила уменьшенное отклонение при использовании наконечника для удаления лишнего материала с наконечника. Наша технология позволяет автоматизировать изготовление гидрогеля для 3D клеточной культуры и тканевой инженерии.
Это недорогое решение для увеличения пропускной способности и воспроизводимости технически сложных рабочих процессов. Предоставляя настраиваемый подход с открытым исходным кодом, эта технология прокладывает путь для широкой адаптации автоматизации процессов в исследованиях тканевой инженерии.
