生物医学研究は、新しい研究成果が治療用途にはほとんど変換されないという点で再現性の危機に直面しています。このプロトコルは、人的要因を減らし、製造に自動化と標準化を導入します。この方法は、ヒドロゲルが過去10年以内に癌および他の疾患組織モデルにおいて最も使用されるプラットフォームとなっているため、3D細胞培養用途のための写真架橋性ヒドロゲルに特に焦点を合わせている。
私たちは、オープンソースの技術プラットフォームの開発により、現在のハードウェアとソフトウェアの制限に首尾よく対処しました。このプラットフォームは、ヒドロゲル用に特別に設計されており、組織工学研究のための自動化された製造ワークフローを可能にします。API をインストールするには、コマンド行インターフェースを開きます。
作業 API をインストールするには、「pip install openworkstation」と入力し、Enter キーを押します。ピペッティングバイオ製造モジュールを操作するには、opentrons APIをインストールするコマンドを入力します。次に、コマンド ラインを使用して Python スクリプトを開き、両方の API が正常にインストールされたかどうかを確認します。
プロトコルコードを生成するには、プロトコル設計アプリケーションを開き、プラットフォームによって実行されるカスタマイズされたプロトコルスクリプトを生成します。インターフェイスは、一般的に使用されるすべてのインターネットブラウザ上で実行されます。セットアップ・ページでプロトコル名を入力し、「続行」をクリックします。
給紙トレイの設定で、3 x 4 個の加熱ブロックを選択して給紙トレイを定義します。材料とストック濃度を定義するには、入力の定義メニューからゲル 1 を選択し、名前として GelMA と入力します。ストック濃度を20%、サンプル数を3に設定し、「追加」をクリックしてエントリを保存し、最初の列に入力します。
入力の定義メニューからゲル 2 を選択し、名前として「アルギン酸」と入力します。ストック濃度を4%、サンプル数を3に設定し、「追加」をクリックしてエントリを保存し、2番目の列を埋めます。図に示すように光開始剤および希釈剤パラメータを設定した後、光架橋を選択し、時間を30秒に設定し、強度を2に設定して[OK]をクリックします。次に、ウェルプレートタイプを 96 ウェルプレートに設定し、「グループ 1」をクリックして、ダブルネットワークヒドロゲルを作成するためのパラメータを指定できるようにします。
次に、必要に応じて [高度なミキシングプロトコルを適用] チェックボックスをオンにし、サンプル数を 96 に設定して、[続行] をクリックします。デッキレイアウトを設定するには、スロットごとに適切なトレイタイプを選択します。すべてのトレイタイプを選択したら、ピペットの左ボックスをクリックし、ドロップダウンメニューから10~100マイクロリットルの正の変位を選択します。
吸引速度を 600 に設定し、ディスペンス速度を 800 に設定します。次に、同じ方法でピペットの正しいパラメータを設定します。次に、「プロトコルの生成」をクリックして、プロトコル・スクリプトを生成して保存します。
プロトコルを実行する前に、消耗品に70%エタノールを噴霧し、ユーザー設定で定義された設定に従って配置します。選択したセットアップに従って、アルミニウムブロック内の材料を含む反応チューブを温度ドックの上に置きます。次に、手袋に70%エタノールをスプレーし、開いたチューブに触れずに反応チューブを慎重に開きます。
物質が適切な実験温度に達したら、ユーザーインターフェイスを使用して生成されたプロトコルを実行します。ワークステーションはホーミングプロセスから始まり、ストレージモジュールから空のウェルプレートを取得します。ウェルプレートから蓋を取り外した後、プレートは次のモジュールに搬送される。
このプロトコルは、各ストックソリューションからピペットでピペットされる量を指定し、交差汚染を防ぐために各材料の後のチップを自動的に変更します。粘性溶液を再現性のある方法で混合するために、ワークステーションは、粘性ヒドロゲル用に最適化された特定の混合プロトコルを実行する。プロトコル設計アプリは、リザーバの充填レベルを考慮に入れ、粘性材料への不必要な浸漬を防ぐために混合高さを自動的に適応させます。
3Dモデルとウェルプレートの自動生成後、ワークステーションはウェルプレートを蓋で再び閉じ、ウェルプレートをストレージモジュール内のプログラムされた位置に保管します。プロトコルが完了したら、ストレージ・モジュールからプレートを取り外します。実施されたプロトコルの検証と検証のために、プレートを分光光度計にロードし、450ナノメートルで吸光度を2回読み取ります。
吸光度値を保存した後、出版物に補足資料として提供されている分析スプレッドシートファイルを開き、吸光度測定値を生データシートの表にコピーします。次に、分析シートをクリックして平均値、標準偏差、分散係数の値を表示し、96ウェルプレートの特定の行および特定の列の均一なサンプル分布に対して自動的に計算および表示されます。グリセロール溶液の高い再現性を保証するセットアップを見つけるために、温度制御なしでチップタッチなしで、温度制御とチップタッチなしで、または温度制御とチップタッチでプロトコルを生成しました。
3つのセットアップで計算された変動係数値は、温度ドックとチップタッチ機能の有意な影響を明らかにし、両方の機能を使用した場合に再現性の高い結果を生成するプロトコルの能力を強調しました。温度ドックでチップタッチ機能を使用すると、セットアップ3で標準偏差が大幅に減少しました。セットアップ3のサンプル吸光度値をプロットすると、実験全体を通して増減値は得られず、したがって、吸光度値に対するサンプル位置の影響は示されなかった。
次に、20%GelMAストック溶液を希釈し、異なるGelMA希釈液間の差異を評価することによって、GelMA希釈シリーズを調製した。各濃縮ステップで測定された吸光度値は有意に異なり、線形回帰は、異なる濃縮ステップが生成される能力を確認する高い適合を実証した。さらに、セットアップで自動的に生成された5%GelMA、2%アルギン酸、および0.15%LAPのダブルネットワークヒドロゲルについて、先端タッチの影響を評価しました。
先端タッチの統合により、再現可能なデータセットの生成をサポートする標準偏差が大幅に減少します。吸光度値とヒートマップの視覚化により、先端タッチを使用して先端から余分な材料を除去すると、偏差が減少することが確認されました。当社の技術は、3D細胞培養および組織工学のためのヒドロゲル製造の自動化を可能にします。
これは、技術的に困難なワークフローのスループットと再現性を向上させる低コストのソリューションです。カスタマイズ可能なオープンソースアプローチを提供することにより、この技術は、組織工学研究におけるプロセス自動化の広範な適応への道を開きます。
