Синапсы являются функциональными элементами нейронов и их дефекты или потери находятся в основе нескольких нейродегенеративных и неврологических расстройств. Исследования изображений широко используются для исследования их функции и пластичности в физиологических и патологических условиях. Из-за их размера и структуры, локализация исследований белков требуют высокого разрешения методов визуализации.
В этом протоколе мы описываем процедуру изучения в первичных нейронах совместной локализации целевых белков с синаптических маркерами на уровне супер-разрешения с использованием структурированной микроскопии освещения. SIM - это узорчатая техника освещения света, которая удваивает пространственное разрешение широкой микроскопии, достигая детализации около 100 нанометров. Протокол указывает необходимые элементы управления и настройки для надежных исследований совместной локализации и обзор статистических методов для правильного анализа данных изображений.
Ключом к разрешению анализа на уровне супер-разрешения, однако, являются реагенты, используемые во время приобретения, такие как камерные крышки и монтажные решения, совместимые с индексом дифракции цели. Чтобы получить мышь гиппокампа первичного нейрона, изолировать гиппокампа от P1 до P4 щенков. Клетки плиты на 70 000 клеток на колодец в объеме 200 микролитров на колодец.
Подождите, пока гиппокамп первичных нейронов полностью созрели от 12 до 14 дней после покрытия для выполнения совместной локализации исследований. Добавить 4%paraformaldehyde, PFA, в PBS 200 микролитров на колодец нейронов, чтобы исправить их быстро. Удалите раствор и инкубировать образцы с 1%бычьей сыворотки альбумин, BSA, в PBS на 200 микролитров на колодец в течение одного часа при комнатной температуре, чтобы пассивно покрыть все свободно связывающие поверхности пластины с неуместным белка для анализа.
Блокирующий буфер на основе BSA без Triton X-100 снижает фон антител более эффективно, чем тот же буфер с 0,2%Triton X-100. Добавьте первичное антитело. В качестве отрицательного контроля, не добавляйте никаких первичных антител к одной из скважин.
Маунт-клетки с помощью SIM-совместимого крепления, например ProLong Glass Antifade Mountant. Накройте и защитите клетки стеклом, например, круглым стеклом диаметром восемь миллиметров.
Квадратные также могут быть использованы. Храните камерные крышки при комнатной температуре и подождите не менее 48 часов, прежде чем получить изображения. Алмазное стекло требует не менее двух дней лечения до приобретения супер-разрешения.
Используйте две стратегии для обеспечения специфичности антител. Во-первых, использование по крайней мере двух различных антител, нацеленных на один и тот же субстрат. Второй стратегией является нейтрализация антител путем инкубации с целью очищенного белка, или используется для повышения антитела.
Мы регулярно используем микроскоп N-SIM супер-разрешения изготовленный Nikon для нашего анализа. Инструкции, которые следуют должны быть предназначены для приобретения SIM-изображений независимо от микроскопа использования. Важно также максимизировать производительность микроскопа для выполнения точной калибровки инструментов, включая коррекционное кольцо, лазерное выравнивание и фокусировку блока решетки.
Перед приобретением SIM-изображений система требует надлежащей калибровки с определенными флуоресцентными бусинками подпоколения. Примером могут быть микросферы TetraSpeck. Эти бусы окрашены различными флуоресцентными красителями, чтобы позволить калибровку различных лазеров с одним образцом.
В водяной бане, sonicate около 1,8 раза 10 до 8 флуоресцентных микросфер в течение 10 минут. Разбавить флуоресцентные микросферы один из 500 в двойной дистиллированной воды. Sonicate второй раз в течение дополнительных 10 минут.
Пипетка 15 микролитров разбавленных бусинок в колодец камерной крышки. Дайте раствору высохнуть в течение пяти минут при комнатной температуре. Добавьте 10 микролитров монтажного раствора, например.
ProLong стекла, и место восемь миллиметров крышки на вершине. Подождите, по крайней мере 48 часов, чтобы надлежащее лечение. Включите микроскоп и лазеры.
Пусть система прогревется, чтобы достичь теплового равновесия всех компонентов микроскопа, а система микроскопа супер-разрешения SIM требует не менее трех часов. Выберите цель 100X. Начните калибровку путем выравнивания лазеров к центру блока решетки дифракции.
В системе N-SIM микрометровая ручка и специальная камера позволяют центрирование световых лучей к цели. Вставьте камерные крышки микроскопа для просмотра. Установите систему на толщину камерного покрытия, регулируя объективную коррекцию крышки.
NIS Software, несвободное программное обеспечение, предоставляемое системами микроскопов супер-разрешения N-SIM, имеет автоматическую функцию регулирования коррекции цветов. Отрегулируйте фокус блока решетки для каждого канала для того чтобы обеспечить сфокусированное структурированное освещение картины на образце. Программное обеспечение обеспечивает автоматическую функцию для этой задачи.
Приобретайте необработанные 3D SIM-изображения многоцветных микросфер. Рассчитайте для каждой отдельной длины волны преобразование Фурье сверхобувяжяемого изображения. Если преобразованное изображение не может получить правильный цветочный шаблон, перезапустить калибровку, так как супер-разрешение не было достигнуто.
На супер-решенном изображении выберите единую микросферу и вычислите ее профиль интенсивности для каждого канала для измерения достигнутого разрешения. Теперь она должна быть близка к 100 нанометров боковой. Выполните регистрацию канала, наложить многоканарновое приобретение микросфер.
Цель состоит в том, чтобы коллиматировать все сигналы канала с боковой и аксиально. Это позволит устранить хроматические аберрации из-за несогласованности различных каналов и поможет анализу совместной локализации. Подтвердите качество калибровки с помощью фазового шага освещения функций и освещения узорчатого фокуса SIMcheck, набора плагинов для приложения с открытым исходным кодом ImageJ.
Начните анализировать образец с помощью цели 40X в конфокальных или широкоугольном режиме. Это позволяет осуществлять навигацию образца, сохраняя хорошую детализацию и большое поле зрения. Используйте сигнал антител MAP2 для обнаружения области, представляющей нейронные процессы.
Приобретайте изображения образца в конфокальцном режиме, чтобы определить качество окрашивания. Переключитесь на цель 100X. Нанесите масло на цель 100X.
Приобрети широкое поле или конфокальные изображения, которые будут использоваться позже для оценки качества супер-решенного изображения. Переключитесь на 3D-режим SIM. Используя диалоговые окна для настройки параметров приобретения, выберите параметр глубины бита, доступный для максимизации информации о цвете.
Как правило, 16 бит является стандартным выбором. Кроме того, чтобы улучшить соотношение сигнала к шуму, выберите низкочастотное значение для приобретения, например, один мегагерц. Используя гистограммы окна, установите лазерную мощность для получения линейной реакции сигнала, чтобы избежать потери информации, ограничьте насыщенные пиксели на изображениях.
Система N-SIM использует камеру Andor iXon3. При работе на 16 бит, выбрать целевую интенсивность 16000 для обеспечения линейной реакции камеры. Кроме того, выберите диапазон от 30 000 до 45 000, чтобы максимизировать динамический диапазон приобретений.
Установите мощность лазера между 0,1%и 50% при визуализации образцов и время экспозиции от 50 миллисекунд до двух секунд. Лазерные силы выше 50% могут вызвать быстрое фотоотравливания флюорофоров в использовании. Начните приобретать изображения в 3D SIM-режиме.
Используйте SIMcheck, набор бесплатных плагинов для ImageJ, чтобы оценить качество приобретения необработанных изображений. Если SIMcheck не обнаруживает никаких артефактов или проблем с качеством, приобрети как минимум 10 изображений из полных технических репликаций, чтобы позволить статистический анализ. Приобретенные изображения являются необработанными данными, которые необходимо обрабатывать для получения реконструированных SIM-изображений, которые будут использоваться для дальнейшего анализа.
В протоколе мы предлагаем использовать синаптофизин и PSD-95 в качестве пред- и постсинаптических маркеров. Дополнительные маркеры, однако, могут быть использованы. Огромное количество литературы поддерживает использование других белков, таких как дребрин и фагот в качестве синаптических маркеров.
3D SIM-изображения являются необработанными изображениями, которые необходимо обрабатывать для получения реконструированных изображений с супер-разрешением. Неправильная реконструкция необработанных изображений может привести к артефактам, которые повлияют на анализ образцов. Поэтому большое внимание следует уделить правильному выбору параметров реконструкции.
Обработка необработанных изображений с помощью программного обеспечения для анализа реконструкции микроскопа для получения сверхохватного изображения. Кроме того, используйте свободно доступный плагин ImageJ fairSIM для восстановления необработанных изображений. Рассчитайте преобразование Fourier супер-решенных изображений с помощью программного обеспечения для реконструкции микроскопа или плагина ImageJ SIMcheck.
Хорошее реконструированное изображение должно вернуть для каждого канала изображение, похожее на цветок. Если реконструированные изображения не могут воссоздать цветочную форму, перезапустите необработанные изображения и реконструируете их путем изменения параметров реконструкции, таких как линейная фильтрация, аподизация и подавление нулевого порядка. В программном обеспечении NIS с помощью предварительного просмотра для мониторинга того, как изменение параметров влияет на окончательное разрешение изображения, изменить контраст модуляции освещения параметра, подавление шума с высоким разрешением, и из фокуса подавления.
Проанализируйте реконструированное изображение, чтобы объективно обнаружить артефакты с помощью NanoJ-SQUIRREL, плагина на основе ImageJ, для оценки качества сверхразображенных изображений. В нашем анализе совместной локализации мы использовали два подхода. Первый — это визуальный подход, основанный на анализе профиля, который показывает отдельные события совместной локализации и определяет вклад каждого канала.
В качестве первого шага к изучению совместной локализации между синаптических маркеров и белка интереса, принять супер-разрешенное изображение и проанализировать один локус для определения перекрытия сигнала. Определите один локус на супер-решенное изображение. Получить интенсивность профилей флуоресцентных сигналов на локус интереса.
Если анализ профиля предполагает однофокусную локализацию, более общий анализ всего изображения может быть проведен путем расчета коэффициентов Пирсона и Мандера. Используйте плагин JACoP, ImageJ, чтобы определить два параметра совместной локализации: Pearson's и Mander's. После калибровки системы и оценки качества реконструированных изображений, мы затем начали анализировать первичные нейронные культуры, окрашенные антителом против MAP2, нейронального маркера, PSD-95, постсинаптического маркера и нашего целевого белка SUMO1.
Сначала мы проанализировали образец, выполняющий четырехканайную конфокальцную микроскопию с целью 40X. Выбрав область, представляющую нейронные процессы, мы перешли к цели 100X. Мы приобрели как конфокальные, так и SIM-изображения одной и той же области для оценки качества реконструкции с NanoJ-SQUIRREL и проведения анализа совместной локализации.
Выяснение структуры и состава синапса имеет решающее значение для понимания как физиологических, так и патологических процессов, которые регулируют память и познание. В то время как в нормальном состоянии синапсы являются строительными блоками памяти, они также находятся на основе сложных неврологических расстройств, таких как одна из наиболее распространенных форм болезни Альцгеймера деменции. Описанный здесь протокол позволяет изучать белковый состав синапсов с помощью метода микроскопии супер-разрешения, называемого структурированной микроскопией освещения.
