Muitas gestações falham no desenvolvimento de embriões humanos em torno dos sete ou oito pós-fertilização. Este protocolo oferece oportunidades aos investigadores para cultivar conceitos humanos in vitro durante esta misteriosa janela de implantação. Isso nos permite compreender os mecanismos que sustentam o sucesso da implantação humana e da formação placentária precoce.
Usar um sistema de cultura estendido para cultivar embriões humanos em estágio de peri-implantação in vitro é provavelmente a única maneira de obter materiais autênticos para estudar a implantação e a diferenciação do trophoblasto precoce. Esta técnica simples é uma ferramenta poderosa que nos permite responder muitas perguntas fundamentais sobre o desenvolvimento precoce humano. Pesquisas realizadas com o uso deste protocolo contribuirão em grande parte para a compreensão da perda precoce da gravidez, da falha recorrente da implantação e das patologias da placenta.
Demonstrando o procedimento estará Deirdre Logsdon, a doutoranda de um laboratório. Um dia antes do aquecimento do embrião, preparem a mídia e as placas de recuperação em um capô de fluxo laminar estéril. Encha dois pratos de lavagem de cultura de órgãos do centro com 500 microliters de BM com 10% SPS, depois cubra o BM com 500 microliters de óleo de grau de cultura de embriões.
Em um prato de cultura de tecido de 16 milímetros, a camada oito mililitros de óleo de cultura de embriões e ancora 20 gotas de microliter de BM com 10% SPS para o fundo. Equilibre os pratos de lavagem e a placa de recuperação em uma incubadora a 37 graus Celsius, 6% de dióxido de carbono e 5% de oxigênio por pelo menos quatro horas. Aliquot aproximadamente quatro mililitros de IVC 1 em um tubo de tampa de snap de cinco mililitros e prepare um prato de lavagem com 500 microliters de IVC 1 sem sobreposição de óleo.
Equilibre o prato e o tubo na incubadora por pelo menos quatro horas. Fibronectina diluída do soro humano em PBS para 30 microgramas por mililitro. Abra o pacote de tampas bem câmara, tomando cuidado para não tocar nos poços, em seguida, delicadamente pipeta 250 microliters da fibronectina em cada poço.
Substitua a tampa da tampa e incuba-a a quatro graus Celsius por 20 a 24 horas. Prepare a placa de cultura estendida na manhã do aquecimento do embrião. Recupere o deslizamento de cobertura com fibronectina e coloque-o na capa de fluxo laminar.
Em seguida, remova a mistura de fibronectina com uma pipeta de um mililitro e descarte-a. Pipeta 300 microliters do IVC equilibrado 1 em cada poço e coloque o deslizamento na incubadora até a remoção da zona pellucida. Após o aquecimento e recuperação dos embriões humanos D5, avalie-os para a reesqueso e tire fotos de cada embrião.
Mova cada embrião para 500 microliters de um meio de manuseio tamponado MOPS com 5% de FCS. Em seguida, trate-o com a solução ácida de Tyrode, conforme descrito no manuscrito do texto. Mova imediatamente o embrião com a zona dissolução em 300 microliters de meio tamponado MOPS aquecido para saciar a solução do Tyrode.
Em seguida, mova o embrião para um prato de tecido de órgão de poço central contendo o BM equilibrado com 10% sps sob o óleo de grau de cultura embrião. Em seguida, devolva o embrião para a queda de recuperação de 20 microliter. Mova individualmente os embriões para o prato de lavagem com a mídia de IVC 1 equilibrada, em seguida, mova cuidadosamente cada embrião para um poço do deslizamento de cobertura câmara, certificando-se de acompanhar a identificação do embrião.
Devolva a tampa de câmara para uma incubadora fixada a 37 graus Celsius, 6% de dióxido de carbono e oxigênio atmosférico por dois dias. No segundo dia de crescimento, examine cuidadosamente a fixação dos embriões sob o microscópio e troque a mídia. Saiba qual embrião está preso ao prato batendo suavemente na placa.
Para alterar a mídia, remova a tampa e aspire cuidadosamente 150 microliters de IVC 1, tomando cuidado para não perturbar o embrião anexado. Se um embrião ainda não tiver ligado à placa, não troque a mídia porque o soro no IVC 1 ajudará na fixação. Pipeta lentamente 150 microliters de mídia de cultura estendida equilibrada, IVC 2 em cada poço e Substitua a tampa na tampa.
Devolveu cuidadosamente o deslizamento de cobertura câmara para a incubadora. Repita a troca de mídia e verifique o anexo todos os dias até que os embriões estejam prontos para fixação ou digestão celular única. Se a coleta de mídia gasta for necessária para análise suplementar, congele os 150 microliters do IVC removido 1 em um tubo estéril de baixa ligação de 0,5 mililitro.
Lave cada embrião uma vez com 200 microliters de PBS, depois adicione 200 microliters de solução de trippsina a cada poço. Devolva a tampa de câmara para a incubadora por cinco minutos. Use uma pipeta pequena ou uma pipeta bucal finamente puxada para pegar um MTB individual e, em seguida, use uma pipeta maior para dissociar suavemente o embrião aspirando para cima e para baixo.
Continue aspirando o embrião suavemente e repetidamente usando uma ponta de pipeta de diâmetro menor até que o embrião tenha sido incubado por um total de 10 minutos em trippsina. Para realizar a seleção celular única, mova as células dissociadas através de 320 gotas de lavagem de microliter de PBS e 0,1% PVP sob óleo de cultura de embriões, tomando cuidado para não perder nenhuma célula. Depois de lavar as células use uma pipeta de vidro finamente puxada para selecionar uma célula.
Pipete cuidadosamente a célula única em um tubo de ligação baixa de 0,2 mililitro estéril com um volume mínimo de PBS e PVP. Encaixe células únicas livres em nitrogênio líquido e armazene-as a 80 graus Celsius negativos para uso posterior. Embriões saudáveis apresentaram proliferação contínua ao longo da cultura estendida, enquanto embriões anormais começaram a se retrair de suas bordas externas e se desintegrar.
No oitavo dia de fertilização pós-fertilização, a maioria das células nos embriões eram citotrofoblastos ou CTBs, que foram positivos para o marcador gata-3. Na periferia do embrião, os CTBs já estavam se diferenciando em sincitotrofoblastos multinucleados, que tinham uma folha como aparência e manchada positiva para humanos CGB. No dia 10, a formação de células trophoblastos migratórios positivos CGB estava no máximo, o que foi confirmado pelo aumento da produção de HCG na época.
Os trophoblastos migratórios que mancharam positivo para o HLA-G, também começaram a emergir e migrar para longe do corpo embrionário. No dia 12, a diferenciação do STB estava em declínio e a produção de MTB tornou-se mais proeminente, sugerindo uma mudança de ênfase da produção hormonal no dia 10 para a migração celular no dia 12. Essas alterações podem ser observadas em um vídeo de lapso de tempo do período de peri-implantação.
O vídeo demonstra o colapso da blastocele, a formação do STB e a eventual diferenciação e migração do MTB. A coisa mais importante a ter em mente ao completar este procedimento é que você está trabalhando com embriões vivos que são sensíveis a mudanças de temperatura, osmolalidade e pH. Minimizar o tempo que os pratos estão fora da incubadora é fundamental para manter a saúde dos embriões.
Após a conclusão deste procedimento, os pesquisadores podem usar células únicas isoladas para ensaios de omics de células únicas a jusante, como sequenciamento de RNA de células únicas e sequenciamento de bisulfato de genoma inteiro para entender melhor as alterações epigenéticas e transcriômicas durante a implantação humana e a formação precoce da placenta.
