Molte gravidanze falliscono all'inizio dello sviluppo dell'embrione umano intorno ai sette o otto post-fecondazione. Questo protocollo offre agli investigatori l'opportunità di far crescere i conceptor umani in vitro durante questa misteriosa finestra di impianto. Questo ci permette di comprendere i meccanismi che sono alla base del successo dell'impianto umano e della formazione placentare precoce.
L'uso di un sistema di coltura esteso per far crescere gli embrioni umani allo stadio di periimpianto in vitro è probabilmente l'unico modo per ottenere materiali autentici per studiare l'impianto e la differenziazione precoce dei trofoblasti. Questa tecnica semplice è uno strumento potente che ci consente di rispondere a molte domande fondamentali sullo sviluppo precoce umano. La ricerca condotta con l'uso di questo protocollo contribuirà in gran parte alla comprensione della perdita della gravidanza precoce, del fallimento ricorrente dell'impianto e delle patologie della placenta.
A dimostrare la procedura sarà Deirdre Logsdon, dottorando di un laboratorio. Un giorno prima del riscaldamento dell'embrione, preparare i supporti e le piastre di recupero in una cappa sterile a flusso laminare. Riempire due piatti di lavaggio con coltura di organi center well con 500 microlitri di BM con 10%SPS, quindi coprire il BM con 500 microlitri di olio di coltura embrionale.
In un piatto di coltura tissutale di 16 millimetri, strato otto millilitri di olio di coltura embrionale e ancorare 20 gocce di microlitri di BM con 10%SPS sul fondo. Equilibrare i piatti di lavaggio e la piastra di recupero in un'incubatrice a 37 gradi Celsius, 6% di anidride carbonica e 5% di ossigeno per almeno quattro ore. Aliquota circa quattro millilitri di IVC 1 in un tubo a scatto da cinque millilitri e preparare un piatto di lavaggio con 500 microlitri di IVC 1 senza sovrapposizione di olio.
Equilibrare il piatto e il tubo nell'incubatrice per almeno quattro ore. Diluire la fibronectina dal siero umano in PBS a 30 microgrammi per millilitro. Aprire la confezione di coverlip ben camerata facendo attenzione a non toccare i pozzi, quindi pipettare delicatamente 250 microlitri della fibronectina in ogni pozzo.
Sostituire il coperchio sul coperchio e incubarlo a quattro gradi Celsius per 20-24 ore. Preparare la piastra di coltura estesa la mattina del riscaldamento dell'embrione. Recuperare lo scivolo di copertura a camera con fibronectina e posizionarlo nella cappa di flusso laminare.
Quindi rimuovere la miscela di fibronectina con una pipetta da un millilitro e scartarla. Pipettare 300 microlitri dell'IVC 1 equilibrato in ogni pozzo e posizionare il coverslip nell'incubatore fino alla rimozione della zona pellucida. Dopo il riscaldamento e il recupero degli embrioni umani D5, valutali per la espansione e scatta foto di ogni embrione.
Spostare ogni embrione in 500 microlitri di un mezzo di manipolazione tamponato MOPS con il 5%FCS. Quindi trattalo con la soluzione acida del Tirolo come descritto nel manoscritto testuale. Spostare immediatamente l'embrione con la zona di scioglimento in 300 microlitri di mezzo tamponato MOPS riscaldato per spegnere la soluzione del Tirolo.
Quindi spostare l'embrione in un piatto centrale di tessuto d'organo contenente il BM equilibrato con 10%SPS sotto l'olio di coltura dell'embrione. Quindi riportare l'embrione alla goccia di recupero di 20 microliter. Spostare singolarmente gli embrioni nella piastra di lavaggio con il supporto IVC 1 equilibrato, quindi spostare attentamente ogni embrione in un pozzo del coperchio a camera, assicurandosi di tenere traccia dell'identificazione dell'embrione.
Riportare il coperchio a camera in un'incubatrice impostata su 37 gradi Celsius, 6% di anidride carbonica e ossigeno atmosferico per due giorni. Al secondo giorno di crescita, esaminare attentamente l'attaccamento degli embrioni al microscopio e scambiare i media. Sapere quale embrione è attaccato al piatto toccando delicatamente il piatto.
Per cambiare il supporto, rimuovere il coperchio e aspirare con cura 150 microlitri di IVC 1, facendo attenzione a non disturbare l'embrione collegato. Se un embrione non è ancora attaccato alla piastra, non scambiare il supporto perché il siero in IVC 1 aiimenterà in attaccamento. Pipettare lentamente 150 microlitri di supporti di coltura estesi equilibrati, IVC 2 in ogni pozzo e Sostituire il coperchio sul coperchio.
Ha restituito con cura il coverslip a camera all'incubatore. Ripetere lo scambio di supporti e il controllo dell'allegato ogni giorno fino a quando gli embrioni non sono pronti per la fissazione o la digestione a singola cellula. Se la raccolta di supporti spesi è necessaria per ulteriori analisi, agganciare i 150 microlitri di IVC 1 rimossi in un tubo sterile a bassa legante da 0,5 millilitri.
Lavare ogni embrione una volta con 200 microlitri di PBS, quindi aggiungere 200 microlitri di soluzione di tripina ad ogni pozzo. Riportare la coverslip a camera all'incubatrice per cinque minuti. Utilizzare una piccola pipetta o pipetta per la bocca finemente tirata per raccogliere una singola MTB, quindi utilizzare una pipetta più grande per dissociare delicatamente l'embrione aspirando su e giù.
Continuare ad aspirare l'embrione delicatamente e ripetutamente utilizzando una punta di pipetta di diametro inferiore fino a quando l'embrione non è stato incubato per un totale di 10 minuti in tripina. Per eseguire la selezione di singole cellule, spostare le cellule dissociate attraverso gocce di lavaggio a 320 microliter di PBS e 0,1%PVP sotto olio di coltura embrionale, facendo attenzione a non perdere cellule. Dopo aver lavato le celle utilizzare una pipetta di vetro finemente tirata per selezionare una cella.
Pipettare con cura la singola cella in un tubo sterile a bassa legante da 0,2 millilitri con un volume minimo di PBS e PVP. Aggancia singole celle libere in azoto liquido e conservale a -80 gradi Celsius per un ulteriore utilizzo. Embrioni sani hanno mostrato una continua proliferazione nel corso della coltura estesa, mentre embrioni anomali hanno iniziato a ritrarsi dai loro bordi esterni e disintegrarsi.
All'ottavo giorno dopo la fecondazione, la maggior parte delle cellule negli embrioni erano citotrofiblasti o CTC, che erano positivi per il marcatore di trofoblasto GATA-3. Alla periferia dell'embrione, i CTC si stavano già differenziando in sincotrofiblasti multi-nucleati, che avevano un aspetto simile a un foglio e macchiati di positivo per l'uomo CGB. Al giorno 10, la formazione di cellule trophoblast migratorie positive del CGB era al massimo, il che è stato confermato dall'aumento della produzione di HCG in questo momento.
Anche i trofoblasti migratori che macchiarono positivamente l'HLA-G iniziarono ad emergere e migrare lontano dal corpo dell'embrione. Al giorno 12, la differenziazione STB era in declino e la produzione di MTB divenne più prominente, suggerendo uno spostamento dell'enfasi dalla produzione di ormoni il giorno 10 alla migrazione cellulare il giorno 12. Questi cambiamenti possono essere osservati in un video time lapse del periodo di periimpianto.
Il video mostra il collasso del blastocele, la formazione della STB e l'eventuale differenziazione e migrazione della MTB. La cosa più importante da tenere a mente quando si completa questa procedura è che si lavora con embrioni vivi sensibili ai cambiamenti di temperatura, osmolalità e pH. Ridurre al minimo la quantità di tempo in cui i piatti sono fuori dall'incubatrice è fondamentale per mantenere la salute degli embrioni.
Dopo aver completato questa procedura, gli investigatori possono utilizzare singole cellule isolate per saggi di omica a singola cellula a valle, come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e il sequenziamento della bisolfito dell'intero genoma per comprendere meglio i cambiamenti epigenetici e trascrittomici durante l'impianto umano e la formazione precoce di placenta.
