Birçok gebelik yedi veya sekiz post-fertilizasyon etrafında insan embriyo gelişiminde erken başarısız. Bu protokol, araştırmacılara bu gizemli implantasyon sırasında insan kavramlarını in vitro olarak yetiştirme fırsatı sunuyor. Bu bize insan implantasyonu ve erken plasental oluşumunun başarısını destekleyen mekanizmaları anlamak için izin verir.
Peri-implantasyon aşamasında insan embriyoları in vitro büyümek için genişletilmiş bir kültür sistemi kullanarak muhtemelen implantasyon ve erken trophoblast farklılaşma çalışma otantik malzemeler elde etmek için tek yoldur. Bu basit teknik bize insan erken gelişimi hakkında birçok temel sorulara cevap sağlayan güçlü bir araçtır. Bu protokolün kullanımı ile yapılan araştırmalar, erken gebelik kaybı, tekrarlayan implantasyon başarısızlığı ve plasenta patolojilerinin anlaşılmasına büyük ölçüde katkıda bulunacaktır.
Prosedürü gösteren Deirdre Logsdon, bir laboratuvardan doktora öğrencisi olacaktır. Bir gün önce embriyo ısınma, steril bir laminar akış başlık medya ve kurtarma plakaları hazırlamak. İki merkezi iyi organ kültürü% 10 SPS ile BM 500 mikrolitre ile yıkama yemekleri doldurun, sonra embriyo kültürü sınıf yağ 500 mikrolitre ile BM kapağı.
16 milimetrelik doku kültürü çanak, embriyo kültür yağı tabaka sekiz mililitre ve çapa 20 mikrolitre BM damla ile 10% SPS altına. Yıkama bulaşıklarını ve geri kazanım plakasını en az dört saat boyunca 37 santigrat derece, %6 karbondioksit ve %5 oksijen le bir kuvözde dengeleyin. Aliquot yaklaşık dört mililitre IVC 1 beş mililitrelik bir çırpıda kapak tüp içine ve hiçbir yağ bindirme ile IVC 1 500 mikrolitre ile bir yıkama çanak hazırlamak.
En az dört saat boyunca kuvözde çanak ve tüp dengeleyin. PBS'deki insan serumundan mililitrebaşına 30 mikrograma kadar fibronektin seyreltin. Kuyulara dokunmamaya özen tayarak sekiz iyi odalı kapaklı paketi açın, ardından her kuyuya 250 mikrolitre fibronektin pipeti yavaşça alın.
Kapak kapağını değiştirin ve 20 ila 24 saat boyunca dört derecede kuluçkaya yatırın. Embriyo ısınma sabahı genişletilmiş kültür plakası hazırlayın. Fibronektin ile odacıklı kapak kayma alın ve laminar akış kaputuna yerleştirin.
Sonra bir mililitrelik pipet ile fibronectin karışımı çıkarın ve atın. Pipet 300 mikrolitre her bir kuyuiçine dengelemiş IVC 1 ve zona pellucida kaldırılana kadar kuvöz içine coverslip yerleştirin. Isınma ve D5 insan embriyolarının kurtarma sonra, yeniden genişleme için bunları değerlendirmek ve her embriyo nun fotoğraflarını çekmek.
Her embriyoya 500 mikrolitre mops tamponlu kullanım ortamı %5 FCS ile taşıyın. Sonra metin el yazması açıklandığı gibi asidik Tyrode çözeltisi ile tedavi. Hemen Tyrode çözeltisi bastırmak için ısıtılmış MOPS tamponlu orta 300 mikrolitre içine eriyen zona ile embriyo taşıyın.
Sonra embriyo kültür sınıf yağı altında% 10 SPS ile dengede BM içeren merkezi bir iyi organ dokusu çanak içine embriyo taşıyın. Sonra 20 mikrolitre lik iyileşme düşüşüne embriyoyu geri getirin. Tek tek elenmiş IVC 1 medya ile yıkama çanağı için embriyolar hareket ettirin, sonra dikkatle odacıklı coverslip bir kuyuya her embriyo taşımak, embriyo kimlik takip emin olun.
Odacıklı kapak kaymasını 37 santigrat derece, %6 karbondioksit ve atmosferik oksijenolarak belirlenen bir kuluçka makinesine iki gün boyunca geri verin. Büyüme nin ikinci gününde, embriyoların mikroskop altında eki dikkatle inceleyin ve medya değişimi. Plakaya hafifçe dokunarak hangi embriyonun tabağa bağlı olduğunu bilin.
Ortamı değiştirmek için kapağı çıkarın ve bağlı embriyoyu rahatsız etmemeye özen gösterip 150 mikrolitre IVC 1'i dikkatlice aspire edin. Bir embriyo henüz plakaya bağlı değilse, IVC 1'deki serum bağlanmaya yardımcı olacağı için ortam değiştirin. Yavaş yavaş pipet 150 mikrolitre liblibed genişletilmiş kültür medya, IVC 2 her kuyuya ve kapak kapağı değiştirin.
Dikkatlice odacıklı kapak kayma kuvöze döndü. Embriyolar fiksasyon veya tek hücreli sindirim için hazır olana kadar her gün ortam değişimi ve eki kontrol tekrarlayın. Daha fazla analiz için harcanan ortamın toplanması gerekiyorsa, çıkarılan IVC 1'in 150 mikrolitresini steril bir düşük bağlama 0,5 mililitrelik tüpe tutturun.
Her embriyo200 mikrolitre PBS ile bir kez yıkayın, sonra her kuyuya 200 mikrolitre tripsin çözeltisi ekleyin. Odacıklı kapak fişini beş dakika lığına kuvöze geri verin. Tek bir MTB almak için küçük bir pipet veya ince çekilmiş ağız pipet kullanın sonra yavaşça yukarı ve aşağı uyararak embriyo ayrıştırmak için daha büyük bir pipet kullanın.
Embriyo tripsin içinde toplam 10 dakika kuluçkaya yatana kadar daha küçük çaplı pipet ucunu kullanarak embriyoyu hafifçe ve tekrar tekrar kullanmaya devam edin. Tek hücre seçimi gerçekleştirmek için, herhangi bir hücre kaybetmemeye dikkat alarak, embriyo kültür yağı altında PBS ve% 0.1 PVP 320 mikrolitre yıkama damla ile ayrıştırılmış hücreleri hareket ettirin. Hücreler yıkandıktan sonra bir hücre seçmek için ince çekilmiş cam pipet kullanın.
Tek hücreyi, pbs ve PVP hacmi en az olan steril 0,2 mililitrelik düşük bağlama tüpüne dikkatlice pipetlayın. Sıvı nitrojen serbest tek hücreleri snap ve daha fazla kullanım için negatif 80 santigrat derece saklayın. Sağlıklı embriyolar genişletilmiş kültür boyunca sürekli çoğalma sergilerken, anormal embriyolar dış kenarlarından geri çekilmeye ve parçalanmaya başladılar.
Sekizinci gün döllenme sonrası, embriyolarda çoğu hücre sitotrophoblast veya CTBs, bu trhoblast marker GATA-3 için pozitif idi. Embriyonun çevresinde, CTB'ler zaten çok çekirdekli senytiotrophoblastlar, görünüm gibi bir levha vardı ve insanlar Için pozitif vitral. 10. günde, CGB pozitif göçmen trofoblast hücrelerinin oluşumu maksimum, bu zamanda HCG üretiminin yükselişi ile doğrulandı.
HLA-G pozitif boyanmış göçmen trofoblastlar da ortaya çıkmaya ve embriyo gövdesinden uzaklaşmaya başladılar. 12. gün itibariyle STB farklılaşması azaldı ve MTB üretimi daha belirgin hale geldi ve 10. Bu değişiklikler peri-implantasyon döneminin zaman atlamalı videosunda görülebilir.
Video blastocele çöküşünü gösterir, STB oluşumu, ve nihai farklılaşma ve MTB göç. Bu işlemi tamamlarken akılda tutulması gereken en önemli şey, sıcaklık, osmolalite ve pH değişikliklerine duyarlı canlı embriyolar ile çalışıyor olmasıdır. Bulaşıkların kuvözdışında olduğu süreyi en aza indirmek embriyo sağlığını korumak için çok önemlidir.
Bu prosedürü tamamladıktan sonra, araştırmacılar, insan implantasyonu ve erken plasenta oluşumu sırasında epigenetik ve transkripsiyonel değişiklikleri daha iyi anlamak için tek hücreli RNA dizilimi ve tüm genom bisülfit dizilimi gibi tek hücreli omik testler için izole edilmiş tek hücreleri kullanabilirler.
